197209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán retrovírus elleni, 3'-azido-3'-dezoxi-timidint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
18 197209 19 tízszer nagyobb mint 0,3 mM MnCk jelenlétében. 80 - 140 mM KCl-nál, és 60 - 100 mM NaCl-nál szintén maximális enzimaktivitást találtunk. A [3H]dTTP bevitele az enzimkoncentrációra vonatkoztatva lineáris volt. A tesztelésben a 3’-azido-5’-trifoszfát-3’-dezoxitimidin-t az AIDV RT kompetitiv inhibitorának találtuk, melynek Ki értéke 0,04 pM, ha template-primer-ként rA-odT(i2- -i8)-at használunk. Az enzima dTTP-re egy 2,81 mM ka értékkel rendelkezik, gondolván azt, hogy a 3’-azido-5’-trifoszfát-3’-dezoxitimidin erősebben kötődik az enzimhez, mint a dTPP. A madár-mieloblasztózis virus, a Moloney murine leukaemia virus és az AIDV RT-kel végzett további kísérletek azt mutatták, hogy a 3’-azido-5’-trifoszfát-3’-dezoxitimidin a DNS lánchossz egy terminátora. (ií> In vitro AIDV-ellenes aktivitás A 3’-azido-3’-dezoxitimidint teszteltük és számos in vitro vizsgálati rendszerben aktívnak találtuk. Gyógyhatást a reverz transzkriptáz (RT) aktivitás vizsgálatával mértük fertőzött, nem-fertőzött és gyógyszerrel kezelt sejtek oldatában. A 3’-azido-3’-dezoxitimidin a H9 és U937 humán limfoblasztóid sejtvonal AIDV fertőzését hatásosan blokkolja 2,7 - 0,0013 /um/ml közötti koncentrációban. Hasonlóan, fehérvérsejttel és tenyésztett perifériás vér-limfocitával stimulált normál PHA fertőzést 0,013 Mg/ml alatti gyógyszerkoncentrációban gátolja. Gyógyszer hozzáadásával és anélkül végzett kisérletben a H9 sejt megmutatja, hogy a 3’-azido-3’-dezoxitimidin leghatásosabb akkor, ha. az az érzékeny sejt vírusfertőzésének idejében mér jelen van, azonban a vírus-ellenes aktivitás nagyobb része még mindig megmarad, ha az AIDV fertőzés kezdetét követő 20 óra után adagoljuk. A virus ismétlődésének gátlása szintén nyilvánvaló volt, ha a gyógyszer csak a vírusabszorpció 20. órája körül volt jelen a sejtben. A hatás 0,13 és 0,013 Mg/ml mennyiségnél megmutatkozott. A 3’-azido-3’-dezoxitimidin a tisztított AIDV vírussal szemben anti-RT aktivitást közvetlenül nem fejt ki. Hasonlóan, krónikusan fertőzött H9 AIDV sejtvonalban a vírus termelésére és felszabadulására a gyógyszer egyáltalán nem, vagy csak gyenge hatással rendelkezik. (iii) Az AIDV fertőzés meggátlása A 3’-azido-3’-dezoxitimidin blokkoló képességét a sejtek AIDV-fertózésére a következő módon határoztuk meg: Klónozott T< pozitív tetanusz-specifikus T-segitő lirafocitákat izolált AIDV vírussal fertőztük (max. 5000 vírus/sejt mennyiségű dózissal kiváltva) és fertőzés után a sejt túlélését ellenőriztük. A tenyészetben 10 nap után a 8,8 és 1,3 Mg/ml 3’-azido-3’-dezoxitimidinnel kezelt fertőzött T sejteken vírusos citopatikus hatás nem volt látható, raig a nem kezelt fertőzött sejtek ötszörös csökkenést mutattak. A sejt-túlélés az előbbi sejtekből származó, HTLV-I transzformált, AIDV-el erősen fertőzött sejtvonalban szintén értékeltük. A 3’-azido-3’-dezoxitimidin 2,7, 0,27 és 0,13 Mg/ml koncentrációban a citopatikus hatást a 7. napra teljesen blokkolja. Sejtmentes vírussal és sejttel társult vírussal előidézett fertőzésben egyaránt védőhatás volt látható. A 3’-azido-3’-dezoxitimidin 0,27 Mg/ml koncentrációban a kevésbé rokon Haiti-izolált AIDV-el előidézett citopatikus hatást szintén hatásosan gátolja. 2. példa Toxicitás vizsgálat A 3’-azido-3’-dezoxitimidint mind egereknek, mind patkányoknak adagoltuk. Mindkét fajnál az LDso érték 750 mg/kg felett volt. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás hatóanyagként 3’-azido-3’-dezoxitimidint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert eljárások szerint előállított 3’-azido-3’-dezoxitimidin hatóanyagot ismert, gyógyászatiig elfogadható folyékony vagy szilárd hordozóanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverjük és adagolásra alkalmas, adott esetben lassú felszabadulású, humán í'etrovirus által kiváltott betegségek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti ejárás, azzal jellemezve, hogy folyékony hordozóanyagként víztől eltérő oldószert alkalmazunk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy steril alkotórészeket alkalmazunk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt injekció formájában állítjuk elő. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt zárt fiola formájában állítjuk elő. 6. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy folyékony hordozóanyagként steril vizet alkalmazunk. 7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt orális adagolásra alkalmas készítménnyé alakítjuk. 8. Az 1., 2. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt tabletta vagy kapszula formájában formulázzuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
