197099. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és készülék baktériumok és fágok mikrobiológiai kölcsönhatását jellemző paraméterek mérésére
3 197099 ‘1 nak a T7 fág letális mutációján alapuló mérési (minősítési) eljárásra vonatkozik, a mérést a hagyományos tarfoltképző aktivitás meghatározására vezette vissza. Az ismert módszerek közös jellemzője, hogy a vizsgálat mindig a fágokra irányul: a fágok és gazdabaktériumaik összekeverése után kialakuló szabad fágok és infekciós centrumok koncentrációjának meghatározásán keresztül következtetnek a paraméterekre. Ez a klasszikus szabad fág-, illetve infekciós centrummeghatározás csak közvetett mérési úton, többórás szeparáción és bonyolult mikrobiológiai műveleteken keresztül lehetséges. Az ismert megoldások további közös jellemzője, hogy csak igen kis multiplicitással (irt; < 10~Ä) keverhetők össze a baktériumok és a fágok (vagyis egy élő fágra több millió baktériumot kell használni a vizsgálatokban), ugyanis csak így biztosítható, hogy a fágok lízísének szekunder hatásai (kiszabaduló új fágok adszorpciója, majd újbóli lízise — láncreakció) egyesével leszámolhatók legyenek szilárd gél táptalajon. A statisztikus hiba ekkor értelemszerűen igen nagy, illetve csökkentése munkaigényes. A fágbaktérium láncreakciók láthatóvá válásához (azaz, ahhoz, hogy a fág hatására a baktériumon jól észlelhető tarfoltok alakuljanak ki) a lízisidő 10-20- szorosának megfelelő időre van szükség. Az ismert vizsgálatok esetén egy kívánt paraméter meghatározásához igen hosszú időre — gyakran egy teljes munkanapra —, ezenkívül egy kisebb mikrobiológiai laboratórium foglalkoztatására van szükség. Nyilvánvaló, hogy ilyen körülmények között a baktériumfág kölcsönhatásából származó paraméterek vizsgálatának biológiai információoldalról jelentkező komoly előnyei nem aknázhatók ki. Igen nagy szükség van tehát olyan eljárásra, amellyel a baktériumok és fágok mikrobiológiai kölcsönhatását jellemző paraméterek egyszerűen, gyorsan, olcsón és megbízhatóan mérhetők. Vizsgálataink során arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy a baktériumok és fágok mikrobiológiai kölcsönhatását jellemző paraméterek közül a multiplicitást index, a látencia idő és szórása, valamint az átlagos fághozam a fágfertőzést túlélő gazdabaktériumok számára visszavezethetően igen egyszerűen meghatározható. így találmányaink értelmében ha a fágfertőzést túlélő baktériumokat megszámláljuk, vagy a baktériumok számával egyértelmű függvénykapcsolatban levő, detektálásra alkalmas fizikai és/vagy kémiai paraméter (például fényszórás, fényabszorpció, ionerősség stb.) egy fágfejlődési ciklus alatt bekövetkező változásait mérjük, a kapott adatokból igen nagy pontossággal, egyszerűen, gyorsan és megbízhatóan meghatározhatjuk a multiplicitású index, a látencia idő, a látencia idő szórása, valamint az átlagos fághozam értékét. Az „egy fágfejlődési ciklus” megjelölésén azt az időtartamot értjük, ami alatt a gazdabaktériumhoz kevert fágok már teljesen behatoltak a gazdabaktériumokba (tehát lehetséges fertőző hatásukat már kifejtették), a megfertőzött gazdabaktériumokból azonban új fágok nem szabadultak fel. Mithogy a mérés a túlélő baktériumok számának meghatározásán alapul, a statisztikai hibák kiküszöbölése céljából nagy multiplicitású fertőzést alkalmazunk, azaz a gazdabaktériumokat azok számárai összemérhető számú fággal fertőzzük meg. A találmány szerinti mérést minden esetben 0,1 és 4 közötti multiplicitási indexű gazdabakiérium-fág komplexeken végezzük, ellentétben az ismert vizsgálatokban alkalmazott, igen kis (10~6 nagyságrendű) multiplicitási indexekkel. A találmány tárgya tehát eljárás baktériumok és fágok mikrobiológiai kölcsönhatásakor létrejövő multiplicitási index (ni;), látencia idő (T) és szórása (o), valamint az átlagos fághozam (C) meghatározására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a vizsgálandó fágot és gazdabaktériumát előkísérlettel meghatározott, 0,1 és 4 közötti multiplicitási indexet eredményező arányban összekeverjük egymással, a keveréket inkubáljuk, az inkubálás időtartama alatt folyamatosan mérjük a baktériumok számával függvénykapcsolatban levő fizikai és/vagy kémiai jellemzőt, és — az inkubációs idő kezdetén és végén mért jellemző értékei alapján meghatározzuk a multiplicitási indexet (ni;), és/vagy — az inkubációs idő alatt mért jellemző időbeli változását leíró görbe idő szerinti első deriváltjából meghatározzuk a látencia időt (T), és/vagy — az inkubációs idő alatt mért jellemző időbeli változását leíró görbe idő szerinti második deriváltjából meghatározzuk a látencia idő szórását (o); vagy b) a vizsgálandó fágot és gazdabaktériumát előkísé lettel meghatározott, 4-nél nagyobb multiplicitási indexet eredményező arányban összekeverjük egymással, a keveréket legalább a gazdabaktérium lízisidejéig inkubáljuk, a keverékből ismert mennyiségű mintát veszünk, a mintát ismert menynyiségű gazdabaktérium-tenyészettel keveijük össze, majd az a) pontban leírtak szerint meghatározzuk a keverék multiplicitási indexét (ni|), és az nijXd XK=C képlet alapján kiszámítjuk az átlagos fághozamot — a képletben tn, a mért multiplicitási index, d a minta hígítása, és K korrekciós tényező. Ahhoz, hogy a találmány szerinti eljárás megbízható és reprodukálható eredményeket szolgáltasson, alapfeltétel, hogy a gazdabaktérium tenyészetét pontosan ellenőrzött körülmények között tartsuk. Az is célszerű, ha a gazdabaktérium osztódási idejét előre meghatározott értékre álhtjuk be. Ez ismert módon, kemosztát felhasználásával oldható meg. A gazdabaktérium-tenyészet minőségét és mérésre való alkalmasságát célszerűen időről időre ellenőrizzük. Tapasztalataink szerint mi( T, o és C értéke akkor határozható meg a legnagyobb pontossággal, ha a mérés kezdetén a gazdabaktériumokat és fágoka. közel 1:1 arányban keveijük össze. Minthogy a fág oldata élettelen anyagként viselkedik és minősége nem változik, a gazdabaktérium osztódási idejér pedig előre meghatározott értékre állíthatjuk 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
