197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
7 197 047 8 hidroxilcsoportjainak foszforilezéséí katalizáló enzim. Transzformáció: külső forrásból származó dezoxi-ribonukleinsav, például plazmid vagy hibrid dezoxi-ribonukleLisav bejuttatása egy sejtbe, és a bejutott dezoxi-ribonukleinsav stabilizálódása a sejten belül. A leírás során az alábbi rövidítéseket használjuk: A adenozin- vagy dezoxi-adenozin-monofoszfát-csoport U uridin-monofoszfát-csoport T dezoxi-timidin-monofoszfát-csoport C citidin- vagy dezoxi-citidin-monofoszfát-csoport G guanozin- vagy dezoxi-guanozin-monofoszfát-csoport I inozin-monofoszfát-csoport dATP dezoxi-adenozin-trifoszfát dlTP dezoxi-timidin-trifoszfát dCTP dezoxi-citidín-trifoszfát dGTP dezoxi-guanozin-trifoszfát dCMP dezoxi-citidin-monofoszfát dGMP dezoxi-guanozin-monofoszfát RNS ribonukleinsav rnRNS messenger-(hírvivő)-ribonukleinsav tRNS transzfer ribonukleinsav rRNS riboszómális ribonukleinsav ds RNS kétszálú ribonukleinsav DNS dezoxi-ribonukleinsav cDNS komplementer dezoxi-ribonukleinsav (egy mRNS-szekvenciából enzimatikusan szintetizált DNS) ds cDNS kétszálú, komplementer dezoxi-ribonuklcinsav ApPr a p-laktamáz gén kifejeződését szabályozó szekvenciák IFN interferon HuLy interferon a humán lymphoblastoid sejtekből. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást. A találmány egy olyan dezoxi-ribonukleinsawal, részletesebben szólva egy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsawal, amely humán lymphoblastoid sejtekből származó dezoxi-ribouukleinsav-szekvenciát vagy ennek egy fragmensét, variánsát vagy mutánsát tartalmazza, és amely szekvencia egy interferonszerű polipeptidet határoz meg; vagy egy olyan dezoxi-ribonukleinsawal, amely hibridizálódik a fenti dezoxi-ribonukleinsavhoz, transzformált gazdasejt, illetve egy humán lymphoblastoid interferon immunológiai és biológiai aktivitásával rendelkező polipeptid, vagy ennek egy fragmense vagy származéka előállítására vonatkozik. A találmány tárgya egy humán lymphoblastoid interferon immunológiai és biológiai aktivitásával rendelkező polipeptid előállítására. Úgy járunk el, hogy legalább egy, a fentiekben ismertetett rekombináns dezoxi-ribonukleinsawal egy gazdasejtet transzformálunk, és a transz.formánsokat tenyésztjük, az adott polipeptidet pedig izoláljuk. A találmány eljárás transzformált gazda-mikroorganizmus előállítására is. A transzformált mikroorganizmusok előállítására tág értelemben úgy járunk el, hogy 1) indukált humán lymphoblastoid sejtekből humán lymphoblastoid po!i-(A)-RNS-t izolálunk, és 1 luLyl FN-mRNS-tartalmát növelj ük, 2) ebből a templátból egyszálű komplementer clezoxi-ribonukleinsavat állítunk elő, és ebből pedig kétszálú cDNS-t. 3) a kétszálú cDNS-t megfelelő vektor dezoxi-ribonukleinsavba építjük be, majd 4) megfelelő mikroorganizmust transzformálunk a kapott rekombináns dezoxi-ribonukleinsawal, 5) a gazda-mikroorganizmust tenyésztjük, a humán lymphoblastoid IFN cDNS-sal vagy dezoxi-ribonukleinsav-fragmensekkel transzformált kiónokat szelektálunk, majd adott esetben izoláljuk a transzformált gazdasejtekből a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavakat, ha szükséges, a polipeptidek IFN-aktivitásának növelésére módosítjuk a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavakat, és végül isméi elvégezzük a 4) és 5) pontban ncgadottakat. A humán lymphoblastoid sejtek indukciója és a HuLylFN mRNS-ben gazdag humán lymphoblasíoid poli-(A)-RNS izolálása A HuLylFN mRNS-ben gazdag humán lymphoblastoid poli(A)-RNS izolálására különböző ismert módszereket használhatunk. A találmány szerinti eljárás során az alábbi lépésekből álló módszert végezzük el: a) A humán lymphoblastoid sejtek indukciója LylFN-szintézisre, b) az indukált sejtek feltárása, c) a lymphoblastoid poli-(A) RNS elkülönítése a szennyező proteinektől, üpoprotcincktől, dezoxi-ribonukleinsavaktól és ribonukleinsavak tói, végül d) az LyJFN-re specifikus niRNS mennyiségének növelése. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a fentieket. a) A humán lymphoblastoid sejtek indukdldsa LylFN szintézisre A humán lymphoblastoid sejtek egy IFN inducer hatására LylFN mRNS-t és ezután humán LyIFN-t termelnek. Megfelelő interferon inducerek például a következők: különböző kémiai anyagok, kétszálú RNS, például poli-(I): poli-(C), vagy különösen bizonyos vírusok, például a paramyxovírusok, pseudomyxovírusok és a reoviridiális családok, például a Newcastle-betegség vírusa (például a llü, Bl, La Sota vagy Texas törzsek), Sendai vírus, mumszvfrus, para-influenzavírus (1, 11 vagy 111 típusa) vagy a Sémiik i Forest vírus. A humán lymphoblastoid sejteket előnyösen Burkitt-límfómában szenvedő betegektől nyerjük. Egy ilyen'sejtvonal, a Namalwa sejtvonal, kimutathatóan nagy mennyiségű interferont termel vírusstimuláláskor (26). A Namalwa sejteken kívül más lymphoblastoid sejteket is használhatunk, például a Daudi sejteket, Akuba sejteket, NC-37 sejteket, RN-2 sejteket és más, ismert sejtvonalakat. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
