197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
25 197 047 26 5) HuLyIFN-szerűaktivitással rendelkező polipeptidek szintézise HuLyIFN-specifikus rekombindns dezoxi-ribonukleinsa vakat tartalmazó E. coli-val A találmány szerinti HuLyIFN cDNS beépítési szakaszokat hibridizációval beépítjük a pBR 322 Pst I helyére (lásd fent). Mivel a pBR 322 Pst I helye a P-laktamáz génen belül esik, amikor a cDNS szakaszt a transzkripciós helyhez képest megfelelő orientációban és a transzláció leolvasási fázisába építjük be, fuzionált proteint kapunk. Ha a beépített cDNS-molekulának saját iniciációs szignálja és/vagy terminációs szignálja a P-laktamáz szekvenciával fázisban helyezkedik el, úgy iniciáció és/ vagy reiniciáció következhet be a második iniciációs szignál helyén, és ebben az esetben nem fuzionált proteint kaphatunk. Még azok a kiónok is értékesek, amelyek interferon aktivitással nem rendelkeznek, annak ellenére, hogy a HuLyIFN cDNS jelen van Ebben az esetben a cDNS beépített szakasz izolálható, és megfelelő módon (lásd 7/ pont) kifejeződő kontrolláló szakaszba juttatható az adott polipeptid nagyobb mértékű kifejeződése érdekében. HuLyIFN cDNS szakaszt tartalmazó rekombináns dezoxi-ribonukleinsavaí hordozó kiónok vizsgálatára (interferon aktivitásának vizsgálatára) ismert módszereket használunk. így például adott sejtsűrűségig növesztjük a sejteket. Ezután összegyűjtjük ezeket, újra szuszpendáljuk és lizáljuk (lb/ pont). A sejtmentes extraktum interferon aktivitását például citopatikus bioméréssel (29) határozzuk meg. Azokat a kiónokat, amelyek megfelelő mennyiségű HuLyIFN aktivitású polipeptideket szintetizálnak, kiválasztjuk; ezek alkalmasak nagy mennyiségű termék előállítására. A kiónokat tenyészthetjük, és a polipeptideket a 7) és 8) pontban megadottak szerint izolálhatjuk. 6) HuLyIFN aktivitású polipeptidek magas szintű kifejezésére alkalmas rekombindns plazmidok előállítása Ahhoz, hogy egy gén megfelelően kifejeződjön, annak a a szabályozó régiók szempontjából megfelelően kell elhelyezkednie, a szabályozó szakaszokhoz tartozik a transzkripció iniciálását, illetve a transzláció indítását szabályozó promoter, illetve riboszómális kötőhely. Ahogy azt a 3d) pontban megadtuk, a pBR 322 plazmidot megfelelő restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és hozzákötjük a HuLy cDNS-hez. A kapott rekombináns plazmid dezoxi-ribonukleinsawal E. coli HB 101 sejteket transzformálunk. Ha például a Pst I helyet használjuk, és az ennek megfelelő restrikciós endonukleázt, úgy a HuLy cDNS a pBR 322 p-laktamáz génjébe épül be. Ezenkívül, ha a ligációt megfelelő orientációban és megfelelő leolvasási fázisban végeztük, úgy olyan fuzionált proteint kapunk, amely a p-laktamáz láncot követően tartalmazza a HuLyIFN aminosav-szekvenciát, Ha a cDNS-t nem a megfelelő leolvasási fázisban és/ vagy orientációban építettük be, úgy a kapott protein nem rendelkezik semmiféle interferon aktivitással. Fordított orientáció esetén a plazmidot újra orientálhatjuk oly módon, hogy a cDNS beépített szakaszt megfelelő restrikciós endonukleázzal (a jelen leírás szerint Pst I enzimmel) kihasítjuk, és a cDNS-t újraligáljuk a linearizált plazmiddal együtt. A kapott hibrid plazmidot E. coli HB 101 sejtekbe transzformáljuk, és ezeket ismert módon vizsgáljuk interferon aktivitásukra nézve. A beépített HuLyIFN cDNS kifejeződésének fo kozására a HuLyIFN cDNS szakaszt az előzőekben ismertetett szabályozó szekvenciák szomszédságába építjük be úgy, hogy a gént (és így a HuLyIFN aktivitású polipeptidet) extra nukleotidok (és így aminosavak) ne előzzék meg. A HuLy!FN-ek esetében az elsődleges transzlációs termék az érett interferon N-lerminális végéhez kapcsolódó szignálpeptideket tartalmazó preinterferon. A szignálpeptid szekvenciák az eredeti termelősejtben transzlációt követően lehasadnak. Az E. coli azonban nem képes lehasítani preteolitikusan ezt az előszekvenciát. így előnyösen megfelelő módszereket használva eltávolítjuk a cDNS szakaszról (lásd lentebb) ezt azelőszekvenciát, így' a primer transzlációs termék az érett interferonszerű polipeptid. Ezért az érett Hu- LyIFN-t meghatározó géni in vitro állítjuk elő, és egy olyan plazmádba építjük be, amely szorosan (operatívan) kapcsolódik egy kifejeződő szabályozó szakaszhoz, például a ß-laktamäz gén kifejeződő szabályozó szekvenciájához. Más kifejezést szabályozó szekvenciák, például a promoter és a riboszómális kötőhely is használhatók, például a laktóz. operon, a triptoíán operon, az arabinóz operon és más operonok kontrol] szekvenciái, továbbá a lambda fág N-génjénck megfelelő szekvenciái és az fd fág köpenyfehéijéjének génje, vagy mások. A szabályozó kontroll szekvencia beépíthető a cDNS szakaszt már tartalmazó plazmidba, vagy eljárhatunk úgy is, hogy a cDNS szakaszt a kifejezés szabályozó szekvenciákat már tartalmazó plazmidba építjük be, de beépíthetjük mindkét dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst (egymást követően) a plazmidba. Eljárhatunk például úgy, hogy az érett HuLyIFN cDNS-t a ß-laktamäz kifejezés szabályozó szekvenciájának megfelelő helyére építjük. Mivel az érett HuLyIFN-szerű polipeptidet meghatározó, érett cDNS szakasz nem a transzláció iniciálásához szükséges ATG kodonnal indul, az ATG-triplettet szintetikusan kell előállítanunk. Mivel ismerjük a nukleotid-szekvenclát és a restrikciós endonukleázzal megállapított térképeket, mind a pBR 322, mind pedig a HuLyIFN cDNS esetében, a következők szerint járunk el. A pBR 322 plazmidot a P-laktamáz génen belül cső Pst 1 helyen hasítjuk, és cxonuklcázzal, például Bal 31 enzimmel emésztjük a p-laktamázt meghatározó szekvencia rövidítésére. Használhatunk lambda-exonukleázt (5’-exonukleáz) vagy E. coli 3’-exonukieázt és Sl-nuk!eázt is, A restrigál! plazmidot kéíszrtlú dez.oxi-ribomrklciiisnv linkermoiekulával ligáljuk, a linkermolekulát például azelőzőekben megadott (4b./ pont) triésztermódszerrel állítjuk elő. A linker tartalmazza egy megfelelő 5 10 15 20 25 30 35 4G 45 50 55 60 65 14
