197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
í 1S7 047 2 A találmány tárgya eljárás humán lymphoblastoid interferon vagy ennek egy fragmensének vagy származékának immunológiai és biológiai aktivitásával rendelkező polipeptidek és az azokat termelő transzformált gazdasejtek előállítására. A fenti gazdasejtek és az interferonszerű polipeptidek előállítására rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiát használunk. A találmány szerinti polipeptideket immunmodulátorokként használhajtuk, különösen vírusellenes, tumorellenes és rákellenes szerekként. Az interferonok (IFN) glükozilezett polipeptidek, molekulatömegük 10 000 és 40 000 között van. Gerinces élőlények sejtjei termelik, ha lFN-inducer hatásának tesszük ki, például vírusfertőzéskor, kétszálú RNS hatására, intracelluláris mikrobák, mikrobiális termékek vagy különböző kémiai szerek (1) hatására. Az IFN-ek általában nem találhatók meg a normális, egészséges sejtekben. Az egészséges sejteknek védekezéséhez járulnak hozzá vírusos fertőzés vagy más támadás ellen. Az interferonok immunmodulátor aktivitással is rendelkeznek. Az interferon polipeptidek világos nevezéktanát még nem készítették el. A jelenleg érvényben levő javaslatok szerint (2) az osztályozás az állati eredeten (például Hu — a humán eredetű), az antigén specificitás (a, ß, gamma stb., az a-, ß- vagy gamma-interferon-antitestekkel szembeni antigén-antitest reakció típusa alapján), a szerkezeti és élettani differenciák (a szubtípusokat arab számokkal, például oct, ot2 stb. jelölik), és az interferont termelősejt típusán (például leukocitából eredő: Le, lymphoblastoid eredetű: Ly, fibroblast eredetű: F, stb.) alapszik. így példáula Hu- IFN-a, (Ly) vagy a HuLylFN-oc, azt jelenti, hogy az a-típusií, 1 szubtfpusű olyan interferonról van szó, amely humán lymphoblastoid sejtekből származik. A fenti elnevezéseken kívül jelölnünk kell azt is, hogy az interferont közvetlenül a termelősejtből vagy mikroorganizmus bioszintézisével nyertük, továbbá, hogy az interferon egy adott szubtípus vagy esetleg két vagy több interferon szubtípus keveréke. Az interferon polipeptideket meghatározó dezoxiribonukleinsav-szekvenciák, a rekombináns dezoxiribonukleinsav molekulák és az ezeket tartalmazd gazdasejtek nevezéktana egyelőre még nem megalapozott. Az ilyen típusú dezoxi-ribonukleinsav-szék - venciák nevezéktana a meghatározott interferont zárójelek között adja meg. Például az Escherichia coli HB 101 [Z-pBR 322 (Pst)/HcIF-2h], azt jelenti, hogy a baktérium törzs (E. coli HB 101) tartalmazza a Z-pBR 322 (Pst)/HcIF-2h rekombináns plazmidot, azaz a pBR 322 piazmid a Pst I helyen (az idegen dezoxi-ribonukleinsav beépülés! helye) egy HcIF-a, beépített szakaszt tartalmaz, amely Zürichből (Z) ered. A H betű a humán eredetre utal, a c a komplementer dezoxi-ribonukleinsavat jelöli, és az a, a szubtípusra utal [Weissmann(3)]. Aíentinevezéktani példában az IFN génnek forrása (leukocita) nincs jelezve. A jelen leírásban hasonló nomenklatúrát fogadtunk el, azonban az interferon gének forrását (lymphoblastoid sejtek) jelöljük. Napjainkig három típusú HulFN létezik: HulFN- a, HulFN-ß és HuIFN-gamma. A HulPN-a (előzőleg LelFN-, leukocita interferon- vagy LyIFN-, lymphoblastoid interferonnak nevezték) interferont humán leukocitákkal állították elő (a friss sejteket humán donorok véréből nyerték), és a lympiioblastoid sejtek indukciójával, az indukciót például vírussal végezve (Havell és munkatársai /4/) és Sagar és munkatársai (5). Ez a termék 2-es pH-n stabil (savas körülmények között stabil interferonokat a korábbiakban I típusnak nevezték), és azonos interferon polipeptidek keverékéből áll, amelyek elsősorban a glikoziláció fokában különböznek egymástól [például Rubinstein és munkatársai (6)], különböznek továbbá aminosav-összetételükben is (lásd később). Az eddig tisztított két komponens közül az egyik, amelynek molekulatömege 15 000 és 18 000 közötti, nincs glikozilezve, míg a 21 000—22 000 molekuiatömegű gtikozilezve vau. Stewart és munkatársai (7) közük, hogy a nem glikozilezett interferon lényeges vagy az összes HuIFN-a aktivitását megtartja. A lymphoblastoid sejtekből izolált HuIFN-a amínossv-szekvenciáját leírták [Zoon és munkatársai (8)J. A Hu- IFN-oí különböző alakjai ismeretesek, ezek szerkezetileg és életanilag különböznek egymástól. Az egyes emberek a HulFN-a alléiikus variációit termelik. A HuIFN-ß (előzőleg FIFN vagy FilFN vagy' J-típus) molekulát humán fibroblasztokkal (pl. újszülöttek fitymasejtjeivel) állítják elő oly módon, hogy kétszálú ribonukleinsavval indukálnak, kisebb mennyiségben pedig, a HuIFN-a-val együtt vírussal indukált humán lymphoblastoid sejtekkel. A HulFN-ß 2- es pH-n szintén stabil, így az 1 típushoz tartozik. Eddig legalább két típusú HuIFN-ß molekulát írtak le (33, 48). Molekulatömegük 20 000 és 22 000 között változik. Aminosav-szekvenciájuk részben ismert. A HuJFN-gamma-t (előzőleg I1FN /immun interferon vagy I! típusú interferon/) a T-lyrnphocitákbó! állítják elő, oly módon, hogy antigénekkel vagy mitogénekkel indukálnak. Ez a fehérje 2 pH-n labilis, és szeroldgiailag megkülönböztethető a HuIFN-<x- és HuIFN-ß-töl. A HulFN-ek antivírusos, tumorellenes és rákellenes szerként használhatók fel. Vírusellenes szerként úgy használjuk ezeket, hogy például a vírusos légúti fertőzéseket, a herpes simplex keratitist, az akut bevérzés es conjunctivitist, a varicella zostert, a hepatitis B fertőzést és másokat kezeljük. Tumorellenes vagy rákellenes szerként a HulFN fehérjéket például az osteosarcoma, az. akut myeloid leukémia, a multiple myeloma, a Hodgkin-kór, melanoma, mellrák, lymphosarcoma és papilloma és mások kezelésére alkalmazzák. A HulFN-ek gyógyszerészeti készítményként használhatók orális vagy parenterális adagolással, például topikális, intravénás, intramuszkuláris, intranazális, intradermális vagy szubkuíán adagolásra használható gyógyszerészeti készítményekként, például tablettaként, ampullaként, szirupokként, oldatokként vagy szuszpenziókként, de használhatunk porokat, injekciókat, infúziós oldatokat vagy szuszpenziókat, szemcseppeket, spray-ket stb. A készítményeket általában intramuszkulárisan adagoljuk 1-3 alkalommal naponta, 10* és l()7 egység közötti mennyiségben. A kezelés módja függ a betegségtől, üz adagolás módjától és & beteg állapotától. A vírusos fertőzéseket általában naponta vagy legfeljebb háromszori napi kezeléssel gyógyítjuk, több napon vagy több héten át. A tumoros b 10 16 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
