197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
I y/ JAo u pon át. A kinőtt telepeket minimal és kazaminsavat tartalmazó táptalajra replikázzuk, majd megvizsgáljuk a telepek morfológiáját és növekedésüket minimal táptalajon. Megfigyeltük, hogy a vizsgált sejtek egy része minimal táptalajon nem képes növekedni (auxotróf), ugyanakkor a kontrollként vizsgált, Tn5 transzpozont hordozó pGYOKI25 plazmidot nem tartalmazó Str. lividans 66 sejtek között auxotrófot nem találtunk. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. 1. táblázat Mikro- Tenyésztés orga- kazaminsawal, nizmus auxotróf/vizsgált Tenyésztés penicillinnel, auxotróf/vizsgált sejt % 15 20 Str. lividans 66 0/280 0% 0/160 0% Str. lividans pGYOKI25 8/295 2,7% 12/325 3,6% 25 Mivel spontán mutációval körülbelül minden 30 egymilliomodik sejt válhat auxotróffá, a. fenti kísérlettel kapott eredmények bizonyítják, hogy a Tn5 transzpozont tartalmazó pGYOKI25 rekombináns plazmid jelentős mértékű mutációt vált ki. A Tn5 transzpozon jelenlétét a Streptomyces li- 35 vidans dezoxi-ribonukleinsavában DNS-DNS hibridizációval bizonyítjuk (Purello és Balázs, Anal. Biochem., 128, 393—397, 1983). A hibridizációt P32-izotóppal jelzett (Rigby és munkatársai, J. Mól. Bioi., 113, 237—255, 1977) DNS próbával végez- 40 zük (lásd a 10. példát). A Tn5 specifikus radioaktív próbához hibridizálódó DNS-t autoradiográfiával mutatjuk ki. A kísérlet eredményeit a 13. ábrán adjuk meg. A 13a. ábrán az alábbi restrikciós fragmensek gélelektroforetikus képét látjuk: 1. lambda DNS, HindlII 2. pGYOKI25, BamHI 3. pGYOKI2, BamHI 4. plOll, BamHI 50 5. Str. lividans pGYOKI25 (MNG260), BamHI. A 13b. ábrán a Tn5 specifikus próbához való hibridizációt követően felvett autoradiográfiás képet adjuk meg. Látható, hogy a Tn5 szekvenciát tartalmazó pGYOK125 és plOll pozitív csíkot 55 mutat, míg a lambda DNS és a pGYOKI2 negatív. A pGYOKI25 plazmiddal transzformált sejtek között nagy számban találtunk morfológiai szempontból megváltozott telepeket. Ezek közül néhányat a 10. ábrán mutatunk be. 50 A Tn5 transzpozon génjeinek kifejeződését Streptomyces sejtekben bizonyítjuk oly módon is, hogy a Tn5 szekvenciát hordozó plOll Escherichia coli plazmiddal (R. Simon, személyes közlés) transzformálunk Streptomyces lividans 66 sejteket. 65 A plOll plazmid térképét a 11. ábrán mutatjuk be. A plazmid a Tn5 szakaszon KmR és SmR géneket tartalmaz, az E. coliból származó fragmensen Ivedig kloramfenikol rezisztenciát (CmR) (Kondorosi és munkatársai, Mol. Gen. Genet. 188, 433, 1982). A transzformációt követően vizsgáljuk a transzformált Str. lividans sejtek kanamicin és kloramfenikol rezisztenciáját. A 13. példa C. pontjában részletesen megadott eredmények szerint a plOll E. coli plazmid Tn5 transzpozon szakaszán meghatározott (lásd 11. ábra) kanamicin rezisztencia kiejeződik, gyengébben, de kifejeződik a plazmid más szakaszán lévő CmR gén is. A találmány szerinti eljárás során használt és előállított törzseket letétbe helyeztük a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjte- Ttényébe. A törzsek az alábbi sorszámon szerepellek: Streptomyces lividans 66 [NCA1M B(P) 000257] Streptomyces lividans pIJ41[NCA!M B(P) 000258] Streptomyces lividans pGYOKI2 [NCAIM B(P) 000259] Streptomyces lividans pGYOK125 [NCAIM :3(P) 000260] Escherichia coli pACYC184 [NCAIM B(P) 000261] Escherichia coli UNF510 Tn5 [NCAIM B(P) 000262] Escherichia coli JF1754 [NCAIM B(P) 000263] Escherichia coli plOll [NCAIM B(P) 000264] Escherichia coli pGYOKI2 [NCAIM B(P) 000265] Escherichia coli pGYOKI25 [NCAIM B(P) 000266] Escherichia coli HB101 [NCAIM B(P) 000267] A találmány szerinti eljárással előállított bifunkdonális rekombináns klónozó DNS vektorok antibiotikum rezisztenciát meghatározó géneket tartalnaznak, a pGYOKI2 DNS vektor neomicin, thiisztrepton és kloramfenikol, a GYOKI25 pedig leomicin, thiosztrepton, kloramfenikol, kanamicin és sztreptomicin rezisztenciát biztosít. A találmány szerinti vektorokba természetesen más antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó géneket is beépíthetünk, például aminoglükozidokkal, például tobramicinnel, apramicinnel, sziszomicinrel, gentamicinnel, spektinomicinnel, paramomieinnel, kasugamicinnel stb.; markolid típusú antibiotikumokkal, például narbomicinnel, tilozinnal, eritromicinnel, oleandomicinnel, stb.; ß-laktäm anibiotikumokkal, például cefamicin C-vel, klavuánsawal, cefalosporin C-vel, dezacetoxi-cefalosporin C-vel, thienamicinnel, stb.; poliéter típusú antibiotikumokkal, például szalinomicinnel, nigeriemnél, monensinnel stb. szembeni rezisztenciát meghatározó géneket. Ebben az esetben ügy járunk el, hogy például a GYOKI2 rekombináns vektort Gál restrikciós endonukleázzal, vagy bármely más, a vektort hasító enzimmel kezeljük, majd a hasonló enzimmel való hasítással kapott, rezisztenciát meg-5
