197045. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bifunkcionális rekombináns DNS klónozó vektor és a vektor transzformánsainak előállítására
A találmány tárgya ríj eljárás antibiotikum termelő mikroorganizmusok genetikai információkészletének hatékony megváltoztatására bifunkcionális, adott esetben transzpozont tartalmazó új, rekombináns DNS klónozó vektorokkal, továbbá eljárás ezen vektorok előállítására. A klinikailag jelentős és az állattenyésztésben használt antibiotikumok több mint a felét Streptomycesck bioszinletizálják. A Streptomyccsek antibiotikum bioszintézisének mennyiségi és minőségi befolyásolására éppen ezért igen jelentős gazdsági ered ményekkel j árna. A Streptomyces rekombináns DNS technológia fejlődésének és elterjedésének egyik akadálya, hogy nem ismeretes iparilag jelentős antibiotikumokat bioszintetizáló Streptomyces sejtekben fentmaradó, szelektálható, előnyösen kisméretű, alakítható, több funkciójú klónozó DNS vektor, amellyel előre kiválasztott tetszőleges tulajdonságot meghatározó DNS-szakaszt juttathatunk be egy adott sejtbe, ahol ez az új információ kifejeződik. A találmány célja olyan DNS vektorok előállítása, amelyek a fenti igényeket kielégítik. Közismert, hogy az ipari jelentőségű antibiotikumokat bioszintetizáló mikroorganizmusok termelőképességét úgy fokozzák, hogy mutációt okozó ágensekkel, például szerves vagy szervetlen vegyületekkel, vagy például UV-sugarakkal kezelik a sejteket. A kezelést túlélő sejteket antibiotikum termelőképességük szempontjából vizsgálják. A vizsgált sejtek túlnyomó többsége azonban az adott tulajdonságra nézve nem mutáns. A találmány szerinti eljárással előállított hibrid klónozó vektor DNS-ekkel egy előre kiválasztott tulajdonságra nézve hatékonyan állíthatók elő mutánsok. Az irodalomból ismeretesek Streptomyces plazmid klónozó vektorok (Thompson és inti., Nature, 286, 525, 1980; Hopwood és mti., Microbiology, 376. oldal, 1981; Kieser és inti., Mol. Gen. Genet., 185, 223, 1982). A fenti vektor DNS-ekkel végzett kísérletekből kiderült, hogy a Streptomyces eredetű SLP és SCP plazmidok alkalmasak Streptomycesek klónozására. Horinouchi és mti.: (Agric. Bioi Chem., 44, 367, 1980), Schottel és inti. (J. Bact., 146, 360, 1981) és Rodgers és mti. (Gene, 16, 133, 1982) közleményéből kiderül, hogy előállíthatok Streptomyces és Escherichia coli sejtekben fentmaradó és kifejeződő hibrid DNS vektorok. Horinouchi és mti. fenti közleményük tanúsága szerint Streptomyces kromoszomális DNS fragmenseket építettek be az E. coli pTA2070 és pBR322 plazmidokba és tanulmányozták a Streptomyces gének funkcionális kifejeződését E. coliban. E. coli plazmidból és Streptomyces kromoszóma fragmensekből előállított hibrid plazmidjuk azonban nem alkalmas klónozásra, transzformációra, a transzformánsok pozitív szelekciójára és a klónozott gének expresszálására. Konstrukcióik lethal zygozis negatívak. Schottel és munkatársai E. coli eredetű pACYC plazmidokkal és Streptomyces lividans eredetű pSLP 111 plazmiddal állítottak elő bifunkcionális vektorokat a kloratnfenikoi acetiltranszferáz gén (CAT-gén) expressziójának tanulmányozására. DNS vektoraik nem tartalmaznak 1 O Streptomyces sejtekben szelekcióra és inszerciós aktiváláson alapuló klónozásra alkalmas antibiotikum rezisztencia géneket. Rodgers és munkatársai fenti közleményükben arról számolnak be, hogy' Streptomyces fradiae DNS fragmenseket szubkiónoztak a pH2 plazmidba, majd hibrid vektort állítottak elő a pHV14 E. coli plazmiddal. A kapott pWI IR plazmid sorozat csak egyetlen Streptomyces eredetű gént tartalmaz, így Streptomyces sejtekben inszerciós aktiváláson és pozitív szelekción alapuló klónozási kísérletekhez nem alkalmazható. A jelen leírás szerinti bifunkcionális hibrid plazmidok egyikébe Tn5 transzpozont építünk be. A transzpozonok (pl. Rcznikoll, Cell, M, 307, 1982) transzpozfcióval a DNS más szakaszaiba beépülhetnek és így mutációkat válthatnak ki. A leírás során az alábbi tudományos kifejezéseket használjuk: Rekombináns DNS klónozó vektor — olyan autonóm replikálódó DNS molekula, például plazmid, amelybe egy vagy több további DNS szakaszt építünk vagy építettünk be. Transzformáció — DNS bejuttatása egy befogadó (recipiens) sejtbe, amikor a sejt genotípusa megváltozik és így stabil és öröklődő változások következnek be a genetikai információbaa Az így kapott sejtek a transzformánsok. Érzékeny (szenzitív) és rezisztens sejt — valamely antibiotikum jelenlétében nem, illetve növekvő sejt. Restrikciós enzim és restrikciós fragmens — a DNS-t egy adott bázissorrendű szakaszon hasító enzim, a hasítást követően lineáris restrikciós fragmensek jönnek létre. Beépülési izomer — két vagy több lehetséges rekombináns DNS molekula egyike, amely akkor jön létre, amikor egy DNS fragmenst a recipiens DNS két vagy több lehetséges helyének egyikébe építünk be. Plazmid — autonóm repliklódó, köralakú DNS molekula. Tnmsz|XJZOn — lineáris, önálló replikádból nem képes, antibiotikum rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó, a kromoszómán belül helyét változtató (ugráló) DNS szakasz. NeoR neomicin rezisztens fenotípus ThioR thiosztrepton rezisztens fenotípus CmR kloramfenikol rezisztens fenotípus Tcu tetracikün rezisztens fenotípus KmR kanamicin rezisztens fenotípus SmR sztreptomicin rezisztens fenotípus. A szabadalmi leírásban és a mellékelt ábrákon megadott restrikciós enzimekre vonatkozóan utalunk a Bethesda Research Laboratories, (BRL), Inc., Maryland, USA katalógusára és Roberts közleményére (Nucleic Acids Research, 11, 135, 1983). A fentiek alapján a találmány tárgya antibiotikum rezisztenciát meghatározó DNS szakaszokat tartalmazó, Streptomyces és Escherichia coli sejtekben replikálódó bifunkcionális, adott esetben transzpozont hordozó új rekombináns DNS klónozó vektorok és a találmány szerinti vektorok felhasználásával transzformánsok előállítására. A találmány értelmében a fenti új rekombináns 97 046 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
