197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
17 197 044 37 ”C hőmérsékleten rázzuk a tenyészetet, majd L-agarra szélesztjük [Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972)], a táptalaj ampicillint tartalmaz. A túlélő telepeket szelektáljuk, és vizsgáljuk a várt fenotípust (AmpR, Teís). A vizsgált sejtek között jelen vannak az E. coli K12 HBlOl/pLRl transzformánsok. 4. példa A pLR4 plazmld előállítása A) A pLRl plazmid részleges emésztése BamHI enzimmel 10 pl (10 pg) pLRl plazmid dczoxi-ribonukleinsavat, 5 pl, 1 mg/ml koncentrációjú marha szérum albumint, 29 pl vizet, 1 pl BamHI 1:4 arányban vízzel hígított restrikciós enzim-oldatot és 5 pl alábbi összetételű reakcióelegyet keverünk. A reakcióelegy összetétele a következő (BamHI restrikciós enzimhez használt elegy): 1,5 mól nátrium-kiorid 60 inmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,9 60 mmól magnézium-klorid (literenként) Az elegyet 37'C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át. A reakció leállításához 50 pl 4 mólos ammónium-acetátot és 200 pl 95%-os etanolt adagolunk. A kivált dezoxi-ribonukleinsav csapadékot kétszer 70% -os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk és 20 pl vízben szuszpendáljuL B) A pBR322 plazmid emésztése BamHI enzimmel Az emésztést a 2B) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy BamHI restrikciós enzimet és az ehhez használt reakcióelegyet használjuk a HindlII restrikciós enzim, illetve az ehhez tartozó reakcióelegy helyeit. Az emésztett pBR322 plazmidot 29 pl vízben szuszpeudáljuk. C) A BamHI enzimmel részlegesen emésztett pLRl plazmid és a BamHI enzimmel emésztett pBR322 plazmid Ugdldsa A ligálást a 2C) példában megadottak szerint végezzük. A kapott ligáit dezoxi-ribonukleinsavat TE-pufferban szuszpendáljuk, a dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza az előállítani kívánt pLR4 plazmidot. 5. példa Az E. coli K12 HB101/pLR4 előállítása Az előállítást a 3. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a transzformációt a pLRl plazmid helyett a pLR4 plazmidda! végezzük. A túlélő telepeket a várt fenotípusra (AmpR, Tets) szelektáljuk, a telepek tartalmazzák az előállítani kívánt E. coli K12 HB101/pLR4 íranszformánsokat. 6. példa A pJL120 és a p3L12I plazmidok előállítása A) Az SCP2’ plazmid emésztése EcoRI enzimmel 150 pl (5,7 pg) SCP2* plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, 1 pl vizet, 2 pl, 20 BRL egységet tartalmazó EcoRI restrikciós enzim-készítményt és 17 pl alábbi összetételű EcoRI reakcióelegyet keverünk. A reakcióelegy összetétele a következő: 500 mmól nátrium-kiorid 1000 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5 100 mmól magnézium-klorid (literenként) Az elegyet 2,5 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakció leállítására 15 percen át 65 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubációt. A reakciőelcgyet ismert módon agaróz gél-elektroforézissel analizáljuk, annak bizonyítására, hogy a restrikciós hasítás teljes. A hasított dezoxi-ribonukleinsavat felhasználásig 4 °C hőmérsékleten tároljuk. B) A pBR325plazmid emésztése EcoRI enzimmel Az emésztést a 6A) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy az SCP2* plazmid helyett a pBR325 plazmidot használjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat felhasználásig 4°C hőmérsékleten tároljuk. C) Az EcoRi enzimmel emésztett SCPT és a pBR325plazmid Ugdldsa A 6A/ példában megadottak szerint előállított EcoRi enzimmel emésztett SCP2* plazmid készítmény 40 pl-ét, a 6B) példában megadottak szerint előállított, EcoRi enzimmel emésztett pBR325 plazmid készítmény 10 pl-ét, továbbá 10 pl 0,1 mólos magnézium-kloridot, 10 pl 0,1 mólos ammónium-szulfátot, 10 pl, 2 mmól/1 koncentrációjú adenozin-trifoszfátot, 0,1 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt és 20 pl alábbi összetételű ligációs elegyet keverünk. A ligációs elegy összetétele a következő: 50 mmól trisz-hidrogén-klorid, pH—7,5 10 mmól ß-merkapto-etanol 1 mmól etilén-diamin-tetraecetsav (literenként) és 50 pg/ml marha szérum albumin. A reakcióelegyet 18 órán át 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A reakcióelegyet a ligációs reakció lejátszódásának bizonyítására gél-elektroforézissel ana5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
