197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
29 197 044 30 tomyces lividans protoplasztolásához és növesztéséhez az alábbi közleményben megadott táptalajt használjuk: International Publication (of International Patent Application No. PCT/GB79/00095) No. W079/ 01169, 2. példa. 24. példa A pLR2 plazmid előállítása A) A pIJ6 plazmid emésztése HindiiI enzimmel 20 pl (20 pg) p!J6 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat [lásd Thompson és munkatársai, Nature, 286, 525 (1980)], 5 pl borjú szérum albumint (1 mg/ml), 19 pl vizet, 1 pl HindllI restrikciós enzimet (3 New England Bio Labs. egység) és 5 pl restrikciós reakcióelegyet elegyítünk. Az elegyet 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 50 pl 4 mólos ammónium-acetát-oldat és 200 pl 95%-os etanol adagolásával leállítjuk a reakciót. A kapott dezoxi-ribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben vízmentesítjük, 20 pl TE-pufferban szuszpendáljuk, és —20 °C hőmérsékleten tároljuk. B) A pBR322 plazmid emésztése HindiII enzimmel 8 pl (4 pg) pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleínsavat, 5 pl reakcióelegyet, 5 pl, 1 mg/ml koncentrációjú boíjú szérum albumínt, 31 pl vizet és 1 pl HindllI restrikciós enzimet inkubálunk, 2 órán át, 37 *C hőmérsékleten. A reakció leállítására 10 percen át 60 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd 50 pl 4 mólos ammónium-acetátot és 200 pl 95%-os etanolt adunk hozzá. A kapott dezoxi-ribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk és 45 pl vízben szuszpendáljuk. C) A HindllI enzimmel emésztett plJ6 és a pBR322 plazmidok összekapcsolása A 24A) példában megadottak szerint előállított HindllI enzimmel kezelt plJ6 plazmid 20 pl ét, a 24B) példában megadottak szerint HindllI enzimmel kezelt pBR322 plazmidot, 5 pl, 1 mg/ml koncentrációjú borjú szérum albumint, 1 pl T4 dezoxi- 5 ribonuklcinsav-ligázt és 5 pl ligációs elegyet inkubálunk 4 órán át 16 °C hőmérsékleten. A reakciót 50 pl 4 mólos ammónium-acetát és 200 pl 95%-os etanol adagolásával állítjuk le. A kapott dezoxi-ribonukleinsav csapadékot kétszer 70%-os etanollal 10 mossuk, csökkentett nyomású térben szárítjuk, és TE-pufferban szuszpendáljuk. A szuszpendált dezoxi-ribonukleinsav tartalmazza a pLR2 plazmidot. 15 25. példa Az E. coli K12 HB101 /pLR2 előállítása 10 ml E. coli KI2 IIB101 sejtet [Bolivár és 20 munkatársai, Gene, 2, 75—93 (1977)] centrifugálással ülepítünk, és 10 ml 0,01 mólos nátrium-klorid-oldatban szuszpendálunk. Ezután ismét ülepítjük a sejteket, 10 ml 0,03 mólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, 20 percen át jégfürdőben 25 inkubáljuk, ismét ülepítjük, és végül 1,25 ml 0,03 mólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk. A kapott sejtszuszpenzió alkalmas a transzformálásra. A TE-pufferban lévő, a 24C) példában megadottak szerint előállított pLR2 plazmidot etanollal 30 kicsapjuk, 150 pl 30 mmólos kalcium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, és 200 pl kompetens E. coli K12 HB101 sejttel enyhén összerázzuk egy kémcsőben. A kapott szuszpenziót 45 percen át jégfürdőben inkubáljuk, majd 1 percen át 42 °C-on foly- 35 tatjuk az inkubációt. Ezután 3 ml L-táptalajt [Bertám, J. Bacteriology, 62, 293 (1951)] adagolunk, a táptalaj ml-enként 50 pg ampicillint tartalmaz. Egy órán át 37 °C hőmérsékleten rázás közben inkubáljuk a tenyészetet, majd L-agarra szélcsztjük [Mil- 40 ler, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs., Cold Spring Harbor, New York], amely ampicillint tartalmaz. A túlélő telepeket szelektáljuk, és a várt fenotípusra (AmpR, Tets) vizsgáljuk, ily módon megkapjuk az E. coli 45 KI2 HBI01/pLR2 transzformánsokat. Az előzőekben megadottak szerint eljárva, például az alábbi, I. és II. táblázatban megadott plazmidokat és transzformánsokat állíthatjuk elő. 50 I. táblázat Jellemző plazmidok Példa Plazmid Nagyság E. coli St; _ptomyces száma neve kb-ban marker marker Előállítás 26 pJLl 23 27,8 AmpR, Tetu M A pJL121 Bglll deléciója 27 pJL1200 35,8 AmpR, TetR M az SCP2 EcoRI beépítése a pBR325 EcoRÍ helyére 16
