197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
15 197043 16 szert csökkentett nyomású térben desztillálva eltávolítjuk. A piridint toluollal együtt desztilláljuk, a hexametert pedig 8 ml, 2%-os benzol-szulfonsavval kezeljük, amikor az 5’-csoport lehasad. Ezt a reakciót a 4 és 2 trimerek előállításakor megadottak szerint végezzük. A 10 terméket szilíkagéíen (Merck 60H, 3,5X5 cm) tisztítjuk, a gradiens elúcidt kloroform és metanol 98:2—95:5 arányú elegyével végezzük. A 10 terméket tartalmazó frakciókat szárazra desztilláljuk. Hasonlóképpen, az 5 trimert a 6 vegyülethez kapcsoljuk, és a teljesen védett terméket szilikagélen közvetlenül tisztítjuk. Ez utóbbi vegyületet a 3'végen védőcsoport-hasítjuk, a hasítást a 9 frag mens előállításakor megadottakhoz hasonlóan, trietilamin, piridin és víz elegyében végezzük. Végül a 9 és 10 hexametereket 2 ml vízmentes piridinben, kondezálószerként 75 mg (0,225 mmól) 2,4,6 - tri - izopropil - benzol - szulfonil - tetrazolt használva összekapcsoljuk. A reakciót 4 órán át szobahőmérsékleten végezzük, ezután rotavaporban desztilláljuk, és a desztillációs maradékot szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk. A 160 mg súlyú 11 terméket petroléteres kicsapással izoláljuk. A termék a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint homogén. 20 mg 11 vegyületet 0,5 ml piridinben védőcsoport-hasítunk 7 ml tömény ammonium-hidroxiddal kezelve. A reakciót 8 órán át 60 °C hőmérsékleten végezzük. Ezután a terméket 80%-os ecetsavval kezeljük 15 percen át, szobahőmérsékleten. Az ecetsav desztillációja után a szilárd desztillációs maradékot 4 ml 4%-os, vizes ammónium-hidroxid-oldatban oldjuk és háromszor 2 ml etil-éterrel extraháljuk. A vizes fázist 1-2 ml térfogatúra töményftjük, és egy részét a 12 tisztítására nagy felbontású foíyadékkromatográfiának vetjük alá. A nagy csúcsot mutató frakciókat összegyűjtjük (körülbelül 2,0 O.D,254 egység) és 5 ml térfogatúra töményítjük. A 12 végterméket Bio-gel P—2 1,5X100 cm-es oszlopon sómentesítjük, az eluálást 20%-os, vizes etanollal végezzük. A frakciókat szárazra desztilláljuk és 200 pl vízben szuszpendáljuk, ezután A254:10 oldatot kapunk. A 12 vegyület szekvenciáját kétdimenziós szekvenciaanalízissel bizonyítjuk. A teljes timozín-a-1 gént a 16 szintetikus oligonuklectidból állítjuk elő a szomatosztatin [Itakura és munkatársai (1977)] inzulin [Goeddel és munkatársai (1979)3 és a növekedési hormon [Goeddel, Heyneker és munkatársai, Nature, 281, 544 (1979)] előállítása kapcsán megismert módszereket használva, 10 pg-nyi mennyiségű Tz t15 oligonukleotidot kvantitatív foszforilezünk (gamma- P32)-ATP [New England Nuclear] vegyületet használva T4 polinukleotid kináz [Goeddel és munkatársai (1979)] jelenlétében, amikor 1 Ci/mmól specifikus aktivitású anyagot kapunk, A radioaktívan jelzett fragmenseket 20% poliakrilamid/7 mól karbamid gélen elektroforézist végezve tisztítjuk, és az eluált fragmensek szekvenciáját kétdimenziós elektroforézis/homokromatográfiával bizonyítjuk [Jay és munkatársai, Nucleic Acids, Res., /, 331 (1974)], illetve részleges kígyóméreg-emésztéssel. AT, és Tj6 fragmenseket nem foszforilezzük a következő ligáciős reakciók során bekövetkező, előnytelen polimerizációs reakciók elkerülésére. 2-2 pg fenti oligonukleotidot a 4 fragmens 4 csoportja szerint összekapcsolunk T4-dezoxi-ribonukbinsav ligázzal, ismert módszerek szerint [Goeddel és munkatársai (1979)] a mellékelt 9. ábra szerint eljárva. A reakcióterméket 15% poliakrilamid gélen 7 mól karbamid jelenlétében gél-elektroforézissel tisztítjuk [Maxam és Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 71, 3455 (1977)]. A négy izolált termélet egymáshoz kapcsoljuk, és a reakcióelegyet 10% poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézist végezve szétválasztjuk. A timozin-a-1 génnek megfelelő dezoxi-ribonukieinsavaí (90—105 bázispár) elektroeluáljuk. 0,5 pg pBR322 plazmidot BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk, és a fragmenseket poliakrilamid-gél-elektroforézissel elkülönítjük. A gélről elektroelúcióval izoláljuk a legnagyobb fragncnsí, és ezután a szintetikus dezoxi-ribonukleinavhoz ligáljuk [Goeddel, Hayneker és munkatársai (1979)]. Az eleggyel E. coli K12294 (ATCC 31446.) törzset transzformálunk. A transzformációs elegy 5%-át 20 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-iáptalajra szélesztünk. A kapott négy ampicilinre rezisztens telep tetraciklinre érzékeny, ez azt elenti, hogy a beépülés a tetraciklin rezisztenciát meghatározd génbe történt. A négy telepből izolált plazmidok analízise szerint (ezeket pThal jellel jelöljük) a plazmidok tartalmaznak a) a pBR322-ben nem található BglII restrikciós helyet, ami — ahogy a 7. ábrán is látjuk — a timozin-a-1 gén jelenlétére utal, és b) egy körülbelül 105 bázispárból álló íragmenst, amely a BamHI/EcoRI hasítás során jön létre. A pThal plazmid előállítását a mellékelt 9. ábrán mutatjuk be, az ábra nem méretarányos, és a vastagon kihúzott vonalak az 5’-foszfát-csoportokat reprezentálják. 3. A kezelt pTHal és az LE’ (d)-fragmens reakciója A pTHal plazmid ampicillín rezisztencia gént tartalmaz, és tartalmaz a timozin-oc-l-el meghatározó struktúrgént az 5’-kódoló végén egy EcoRI helyen, illetve a 3’-végen egy BamHI helyen. A timozin gén tartalmaz BglII helyet is. A fentiek szerint előállított LE’ (d)-fragmenst befogadni képes plazmid előállítására a pTHal dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI enzimmel hasítjuk, és ezután az EcoRI fragmensek végeinek tompa végekké való alakítására dTTP és dATP jelenlétében Klenowpolimeráz I enzimmel kezelünk. A kapott terméket BglII enzimmel hasítva olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst kapunk, amely tartalmazza az amplicillinrezisztenciát meghatározó gént, és az ellenkező végen egy ragadós BglII szakaszt és egy tompa véget. A kapott terméket BglII ragadós véget és egy tompa véget tartalmazó LE’-(d)fragmenssel reagáltatva újra körré zárhatjuk T4 ligáz jelenlétében, amikor megkapjuk a pTrp24 plazmidot. Ily módon azon a helyen, ahol a tompa végek ligálása bekövetkezik, újra létrejön az EcoRI hely. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
