197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára
11 197043 12 moter/operator rendszert tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst hordoz. A dezoxi-ribonukleinsav-fragmens kódolja az első proteint (LE’ jellel jelöljük), ez a trp vezető szakaszának első 6 aminosavát és a trp E polipeptid utolsó harmadát, továbbá egy második proteint (D’ jellel jelöljük), amely megfelel a trp D polipeptid első felének; továbbá egy harmadik, a tetraciklin rezisztencia gén által meghatározott proteinből áll. C) A pSOM7A2 plazmid előállítása A pBRH trp plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, és a kapott fragmenseket poliakrilamid gél-elektroforézissel és elektroelucióval izoláljuk. A fragmenseket EcoRI-enzimmcl emésztett pSOMll plazmiddal kombináljuk [ltakura és munkatársai, Sei., 198, 1056 (1977); 2007676A. számú brit szabadalmi leírás]. Az elegyet T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal kezeljük, és a kapott dezoxiribonukleinsawal az előzőek szerint eljárva E. coli K12 294 jelű törzset transzformálunk. A transzformáit baktériumokat ampicillint tartalmazó lemezeken szelektáljuk, és a kapott, ampicillinre rezisztens telepeket telep-hibridizációval vizsgáljuk [Gruenstein és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 72, 3951-3965 (1975)]. A pBRH trp plazmidból izolált, és ezután radioaktívan PJ2-vel jelzett trp promoter/operator rendszert tartalmazó fragmenst használjuk a hibridizációkor próbaként. Több telep pozitív telep-hibridizációt mutat, ezeket kiválasztjuk. Izoláljuk belőlük a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és a beépített fragmens orientációját restrikciós analízissel meghatározzuk. Az analízist BglII és BamHI enzimekkel végezzük, kettős emésztéssel A trp promoter/operator rendszert hordozó fragmenst megfelelő orientációban tartalmazó plazmidot hordozó telepeket LB-táptalajban [Miller (1972)] növesztjük 10 pg/ml ampicillin jelenlétében. Az előállított plazmidot pSOM7A2 jellel jelöljük, és az alábbi kísérletekben használjuk fel. D) A pTrp24 plazmid előállítása 1. Az LE’ polipeptid távolabbi régióit meghatározó kodonokat és a kódoló szál 5’-, illetve 3’- végein Bglll, illetve EcoRI restrikciós helyet tartalmazó gén-fragmens előállítása A pSOM7A2 plazmidot HindllI enzimmel emésztjük, majd úgy emésztjük lambda-exonukleázzal (5’—3’-exonukleáz), hogy az emésztés az LE’-t meghatározó régión belül a Bglll restrikciós hely mellett következzen be. 20 pg Hindlll enzimmel emésztett pSOM7A2-t pufferban oldunk. A puffer összetétele a következő: 20 mmól/1 glicin-puffer, pH=9,6, 1 mmól/1 magnézium-klorid, 1 mmól/1 ß-merkapto-etanol. A kapott elegyet 5 egység lambda-exonukleázzal egészítjük ki, és 60 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. A kapott reakcióelegyet fenollal, majd ezután kloroformmal extraháljuk és etanollal kicsapjak Az LE’-gén-fragmens távolabbi végére EcoRI helyett felismerési hely készítése céljából továbbfejlesztett foszfo-triésztcr-módszerrel [Crea és munkatársai, Proc. Nat, Acad. Sei., 75, USA, 5765 (1978)] 32pCCTGTGCATGAT prímért szintetizálunk, és a lambda-exonukleázos emésztés után kaj>ott LE’-gén-fragmens egyszálú végéhez hibridizáljuk. A hibridizáció elvégzésére 20 pg lambda-exonukleázzal kezelt Hindlll emésztett pSOM7A2 plazmidot 20 pl vízben oldunk, és az oldathoz a fentiek szerint eljárva 80 pikomól 5’-foszforilezett oligonukleotidot tartalmazó 6 pl oldatot adunk. A ízintetikus fragmenst az LE’-t meghatározó szekvencia 3’-végéhez hibridizáljuk, és a megmaradó egyszálú LE’-fragmensen lévő rész dATP, dTTP, .'1GTP és dCTP nukleotidokat és Klenow-polime>áz I enzimet használva kitöltjük. A Klenow-polineráz I a dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I enzimből proteolitikus hasítással kapott fragmens. Thrtalmazza az 5’—3’-polimerizálást elősegítő fehérjét, a 3’—5’-exonukleotikus aktivitást, de nem endelkezik a szülőenzim 5’—3’-exonukleotikus akivitásával [Kornberg, 1974; Freeman és Co., SFO, 98}. A reakcióelegyet 50 °C hőmérsékletre melegítjük fel, majd lassan 10 ‘C hőmérsékletre hűtjük, miután 4 pl Klenow-enzimet adunk. 15 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd íz inkubációt 30 percen át 37 °C hőmérsékleten folytatjuk, és a reakciót 5 pl, 0,25 mólos etilén-diamin-tetraecetsav adagolásával állítjuk le. Fenollal, majd ezután kloroformmal extraháljuk az elegyet és etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsavnt ezután Bglll restrikciós enzimmel hasítjuk, és a fragmenseket poliakrilamid-gélen elkülönítjük. A gélről készült autoradiogram szerint 470 bázispárból álló, várt hosszúságú 32P-jelzett fragmenst kapunk, ezt elektroelúcióval elkülönítjük. A kapott LE’ (d)fragmens Bglll véggel rendelkezik, és egy olyan tompa véggel, amely a primer kezdetével esik egybe. 2. A pTbal plazmid előállítása A pThotl plazmid előállítására a pBR322 plazmidba egy szintetizált, timozin-a-1 terméket meghatározó gént építünk be. A timozin-a-l-et meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szintézise egy szintézist és egy ezt követő ligációt jelent, amelynek során 16 oligonukleotidot (Tj—T16) kapcsolunk a molekulához. Ezeket az oligonukleotidokat a mellékelt 7. ábrán kétfejű nyilakkal jelöljük. Az N-terminális véghez egy Met-kodont (ATG) építünk, és az 5’-végeket egyszálú kohézív végekkel látjuk el abból a célból, hogy az EcoRI és a BamHI enzimekkel hasított plazmidhoz kapcsolhassuk. Ahogy az várható, a gén közepén lévő Bglll hely segítséget jelent a rckombináns plnzmidok analíziséhez. A Tj—’T]S oligo-dezöxi-ribonukleotidokat módosított foszfo-triészter-módszerrel állítjuk elő, teljesen védett tridezoxi-ribonukleotid építőköveket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
