197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
11 197 042 12 /. táblázat folytatása Adagolás Komponens mg/liter tenyészet Az adagolás módja L-valin 60-80 L- met ionin 20-30 L-trconin 40-60 L-szerin 20-40 L-izoleucin 80-100 L-leucin 70-90 L-fenil-alanin 40-60 L-glutamin 1000-1250 D-glükóz 4000-5000 Kolin-klorid 5-15 A sejtek szaporodtak 2,2Xl06 sejt/ml csírakópcs sejtpopuláció-sűrűség csúcséi lókig, ami hasonló a tápanyaggal nem adalékolt és a glutaminnal adalékolt tenyészetekéhez. A szaporodási fázis után azonban egy hosszabb stagnáló fázis alakult ki, 25 amely idő alatt viszonylag kicsi volt a változás a csíraképes sejtpopuláció sűrűségében. Ezt követte egy elnyújtott csökkenő fázis [lásd 1. e) grafikon]. A táptalaj ezt követő analízise azt mutatta, hogy a legnagyobb mennyiségben felhasználódott tápanya- 30 gok a tenyésztés egész ideje alatt feleslegben voltak. A sejtek csírázóképességének végső romlása kapcsolatos volt toxikus katabolitok, így laktát és ammónia felhalmozódásával, mivel azt találtuk, 35 hogy ezek olyan koncentrációban vannak jelen, amelyek citotoxikusnak bizonyulnak, ha a korai exponenciális szaporodási fázisban ezeket mesterségesen a sejtekhez adjuk. A tenyészetek csökkenő fázisa sem volt olyan éles, mint azokban a tényé- 40 szelekben, amelyekben a glutamin kimerült. Az antitestvizsgálatokat IgM-re specifikus, enzimmel kapcsolt immunszorbens meghatározással (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) vagy vörös vérsejt agglutinációs vizsgálattal végeztük. Az antitest-standard az agglutinációs vizsgálathoz ebben és az előző kísérletekben NBI sejtek tápanyaggal nem adalékolt tenyészetéből a tenyészet felülúszója volt. Hivatkozva a 2. ábrára, az antitest a tenyésztés egész ideje alatt a tenyészet felülúszójában felhalmozódott, de azt találtuk, hogy az antitestszintézis specifikus sebessége 0,3 pg/106 sejt/óra értékről a szaporodási fázisban 0,5-re és a tenyésztés utolsó fázisaiban 1,5 pg/106/óra értékre növekedett. A végső antitest-koncentráció körülbelül 116 mg/liter volt, vörös vérsejt agglutinációs titerrel négyszer nagyobb mint a standardé. 2. példa Egy további kísérletet végeztünk annak megállapítására, hogy szükséges-e aminosav-komponenst adni a beadagolt tápanyaghoz. NBI sejteket tenyésztettünk 5 literes levegőztetett fermentorban, magzati borjúszérummal kiegészített DMEM táptalajban. A kezdeti sejtpopuláció-sűrűség körülbelül 0.2X106 csíraképes sejt/ml volt. Amikor a sejtek körülbelül 1X106 csíraképes sejt/ml sűrűségre szaporodtak, a tenyészethez adtunk egyetlen adagban ghitamint, 2 niM beadott koncentrációban és megkezdtük a glutamin, a glükóz és a kolin szívatásos adagolását. így a betáplált komponensek kvantitatív bevitele ugyanaz volt, mint az 1. példa szerinti tenyészetben, azzal az eltéréssel, hogy a tenyészethez a glutaminon kívül nem adtunk oldhatatlan vagy oldható aminosav-adalékot. A beadagolás időtartama körülbelül 50 óra volt. A kapott eredményeket az 1. d) grafikon szemlélteti. A tenyésztés szaporodási fázisa hasonló profilt mutat ahhoz a tenyészetéhez, amely az aminosavakat tartalmazó komplett tápanyagot kapta. A maximális sejtpopuláció-sűrűség 2,5 x10s csíraképes sejt/ml volt. Azt találtuk azonban, hogy az elnyújtott stagnáló fázis helyett a sejtek csfrázóképcsségében hirtelen és gyors csökkenés következett be, a szívatással végzett tápanyag-kiegészítés befejezése előtt, A te- 1 yésztés csökkenő fázisa alatt nyilvánvaló növeke- 45 tíés az antitestszintézisben nem volt megfigyelhető. A végső antitesttiter körülbelül a fele volt annak, amit abban a tenyészetben kaptunk, amely kiegészítő aminosavakat tartalmazó komplett tápanyagot kapott. 50 3. példa A 2. táblázatban összehasonlítjuk a hagyomá- 55 íyos, nem adalékolt tenyészetekből kapott és a tápanyaggal adalékolt szakaszos tenyészetekből kapott (a tápanyag lényegileg az, amit az 1. példa 'ápanyaggal adalékolt szakaszos tenyésztésére ismertettünk) antitesthozamokat, több, rágcsálóból 60 eredő hibridoma sejt vonalra és egy humán, EBV•.mnszformált scjtvonalra. A rágcsáló eredetű sejtvonalakra a szakaszos betáplálás! rendszer 3—7- szeres antitesthozam-növekedést adott. A humán sejtvonalra a szakaszos betáplálás 1,7-szeres anti- 65 ‘esthozam-növekedést mutatott. 7
