197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
7 197042 8 gű (például 70—13Ü mg/liter tenyészet) lizint, arginint, valint, izoleucint és leucint, közepes mennyiségű (például 40—70 mg/liter tenyészet) tirozint, treonint és feníl-alanint és viszonylag kis mennyiségű (10—40 mg/liter tenyészet) cisztint, triplofánt, hisztidint, gíicint, metionint és szerint tartalmazhat. A tápanyag előnyösen tartalmazhat még viszonylag kevés (például 5—20 mg/liter tenyészet) kolint, például kolin-kloridot. A találmány szerinti eljárást használva azt találtuk, hogy hibridoma sejtek szuszpenziótenyészeteiből az antitest-kitermelés jelentősen növelhető. Tipikusan legalább 2,5-szer, gyakran legalább 3—4- szer és néha 7-szer nagyobb összes kitermelést kaptunk, mint a hibridoma sejtek kiegészítő tápanyaggal el nem látott szakaszos tenyészeteiből. Ugyancsak legalább 50%-kal nagyobb kitermelést kaptunk EBV-transzformált, antitestet termelő humán sejtekből, mint a kiegészítő tápanyaggal nem adalékolt sejtekből. Hasonló termékhozam-növekedést értünk el transzficiált állati eredetű sejtek, főképpen tPA-t termelő transzficiált hibridoma és myeloma sejtek tenyészeteiből. A találmány szerinti eljárás előnyös kiviteli módjainál jellemző a bőséges termékképződés azután, hogy a tenyészet exponenciális szaporodása befejeződött. Gyakran a teljes termékhozam 50%-a és néha 80-%-a akkor termelődik, amikor az exponenciális szaporodás már leállt. Az ábrák rövid ismertetése A találmány szerinti eljárást a példák szemléltetik. A példákban hivatozunk a csatolt diagramokra, amelyek jelentése a következő: Az 1. ábra a csíraképes sejtsűrűség és az antitesttiter az idő függvényében, hibridoma sejttenyészetekben, ahol a) egyszerű szakaszos tenyészet, b) és c) egyszerű, adagolt szakaszos tenyészetek, d) és e) a találmány szerint adalékolt szakaszos tenyészetek. Az egyes táptalajok összetétele a következő: a) DMEM + 3% FCS adalék nélkül b) DMEM+3% FCS 1X4 mM glutamin c) DMEM + 3% FCS 4X1 mM glutamin d) DMEM+3% FCS 1X2 mM glutamin Beadagolva: glutamin glükóz kolin e) DMEM+3% FCS 1X2 mM glutamin és oldhatatlan aminosavak Beadagolva: glutamin glükóz kolin oldható aminosavak. A 2. ábra az összes sejtpopuláció sűrűsége, a csíiaképes sejtsűrűség és az antitest-koncentráció az idő függvényében az 1. ábra szerinti e) tenyészetben. A 3. ábra a pSV2 ß-globin, PSV3 Bnc, 1*3.16, pRSV3 és pPRI plazmídok részleges restrikciós térképeit mutatja be. (A tPA és BPV gének transzkripciójának az irányát nyilakkal jelöljük.) Az EcoRl, Baml-ll és Sail restrikciós enzimhelyek |X>zícióit E, B, illetve S betűkkel jelöljük. A különböző szekvenciák eredetét az alábbiak szerint jelöljük: WíWM a pBR322-ből származó DNS; i....1 egér metallotionein promoter; I VvnvI 11 Rous Sarcoma vírus LTR promotere; I "S+1 tPA cDNS gén; szelekciós gén; 1 :Ä2äil SV40 szekvenciák; I SV40 poliA helye; fSSSSd SV40 korai promoter. A 4. dbm a szaporodási profilokat mutatja és a tí’A szintézist pRl 1/10 sejtek által, levegőztetett fermentorban (csíraképcs sejtek A; ELlSA-val meghatározott tPA •; fibrin agar módszerrel meghatározott tPA o. 1. példa A példa hibridoma sejtek szuszpenziótenyészeté\el kapcsolatos kísérleteket ismertet. Az első két kísérlet, a szakaszos tenyésztés és a tápanyaggal egyszerűen adalékolt szakaszos tenyésztés összehasonlító kísérletként szolgál. A kísérleteket NBI egér—egér hibridoma sejtvonalat használva végeztík, ezek olyan monoklonális antitesteket termelnek, amely a B-típusú vérsejtek antigén determinánsára specifikus. Az NBI — alternatív mint NBI/ 19.112.28 ismert — származását és tulajdonságait a 209 425 B számú brit szabadalmi leírás ismertette. Első összehasonlító kísérlet Szakaszos tenyészet NBI hibridoma sejteket tenyésztettünk szakaszosan, levegőztetett fermentorban, szuszpenzióban, 3% hővel inaktivált magzati borjúszérummal (FCS) kiegészített DMEM táptalajban (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium). Egy körülbelül 50 órán át tartó exponenciális szaporodási fázis után a csíraképes sejtpopuláció sűrűsége körülbelül 2X106 sejt/ml értékkel maximumot ért el, ezt követően a szaporodás hirtelen leállt és a sejtek csí- i ázóképessége gyorsan csökkent. Ennek a kísérlet-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
