197028. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-alfa-amino és azido-szteroidok és az ezeket tartalmazó aromatáz inhibítor hatású gyógyszerkészítmények előállítására
Am. Chem. Soc. 72, 4531 (1950)] lényegében véve azonos. Az olyan (II) általános képiéül vcgyületek, melyekben L a megfelelő alkohol reakcióképes észterének maradékát jelenti — ezek pontosabb meghatározása az előbbiekben már megadott — ismert vegyületek, illetve az ismert vegyületek előállítására szolgáló és önmagukban véve ismert módszerekkel előállíthatok. Ugyancsak ismertek a (111) általános képletű vegyülelek és ezek vagy a kereskedelemben beszerezhető termékek, vagy ismert módszerek segítségével előállítható vegyületek. A találmány szerinti vegyületek erős aromatázgátló hatással rendelkeznek. Az aromatáz (ösztrogén-szintetáz) az ösztrogének bioszintézisének legutolsó lépésénél fontos szerepet játszó enzim. Közismert dolog, hogy az androgéneknek ösztrogénekké történő átalakulásánál (mint például az adroszténdion és a tesztoszteron ösztronná és ösztradiollá történő konverziójánál) aromatáz a mediátor; ami mikroszomális P450 enzim és ez fejt ki hatást az androgén szubsztrátumra. Az aromatáz hatására létrejött termékek — vagyis az ösztrogének — a szaporodásban kifejtett lényeges szerepük mellett még a hormonfüggó daganatok növekedése tekintetében is felelőssé tehetők. A fentiek alapján a találmány szerinti aromatázgátló hatású vegyülcteket előrehaladott stádiumban levő, hormonfüggő daganatok kezelésére lehet használni; ilyenek például az emlő-, a petefészek- és a méhdaganatok, illetve a hasnyálmirigy-daganatok. Aromatázgátló tulajdonságaik folytán a találmány szerinti vegyületeket a prosztatahiperplázia kezelésére is fel lehet használni (az említett betegség a prosztata jóindulatú megnagyobbodása). Mindezeken túlmenően a találmány szerinti vegyületek csökkentik az ösztradiol képződését és így azok férfiaknál fellépő termékenységi zavarok kezelésére is alkalmazhatók (Drugs 28: 263, 1984). A jelen találmány szerinti vegyületek aromatázinhibitor hatását mind in vitro (emberi méhlepényaromatáz), mind in vivo (petefészek - aromatáz - aktivitás) meghatároztuk, az utóbbit patkányokon. A találmány szerinti vegyületek erős aromatázgátló hatása különösen az in vivo kísérletekben mutatkozott meg. Az aromatázgátló hatást in vitro az alábbiakban leírt módon határoztuk meg: Az enzimrendszert a szokásos módszerrel emberi méhlepény-szövet mikroszomális frakciójából izoláltuk. Magát a mérést Thompson és Siiteri módszerével végeztük [lásd: E. A. Thompson és P. K. Siiteri, J. Bioi. Chem. 249, 5364, (1974)], melynek során az aromatizálás mértékére a 4 - [lß,2ß - 3H] - androsztén - 3,17 - dionból felszabaduló 3H mennyiségének mérésével lehet következtetni. Az összes inkubálási műveletet levegőn végzett rázás közben, vízfürdőn, 37 °C hőmérsékleten végeztük, mimellett a közeg 7,5 pH-jú 10 mmőlos kálium - foszfát -puffer volt, amely még 100 mmól kálium - kloridot, 1 mmól EDTA-t és 1 mmól ditio - treitet is tartalmazott. A kísérleteket 1 ml inkubációs térfogatban végeztük és ezek az 1 ml-es kísérleti oldatok 50 nanomól 4 - [3II] - androszténdiont, különféle koncentrációban inhibitort, 100 pmól NADPH-t, valamint 0,05 mg mikroszomális proteint tartalmaztak. 15 percig tartó inkubálás után a 5 1 /} reakciót 5 ml kloroform hozzáadásával leállítottuk. Ezután 5 percig tartó centrifugálást végeztünk 1500 g-t eredményező sebességgel, majd a keletkezett 3H20 meghatározásához a vizes fázisból alikvot részt (0,5 ml) vettünk. Valamennyi vizsgált vegyületre nézve grafikusan ábrázoltuk a %-ban meghatározott gátlást az inhibitor-koncentráció logaritmusának függvényében és így meghatároztuk valamennyi vizsgált vegyület IC50-értékét — vagyis azt a koncentrációt, ami a kísérleti körülmények között az aromatáz hatásának 50%-os csökkenését eredményezi. Végül az egyes vizsgált vegyületek relatív hatásosságát a 4—OH—A (4 - hidroxi - androszt - 4 - én - 3,17 - dión; lásd a későbbiekben) hatásosságához viszonyítva az alábbi összefüggés segítségével számítottuk ki: Relatív hatáserósség ■= A 4—OH—A IC5,i-éi1éke A vizsgált vegyület IC30-értéke Az aromatázgátló hatást in vivo patkányokon határoztuk meg az alábbiakban leírt eljárással: Kifejlett nőstény patkányoknak két ízben, 4 napos eltéréssel 100-100 N. E. (I. U.) PMSG-t (pregnant «tares’ serum gonadotropin, azaz terhes kancák szérumából nyert gonadotropin) adtunk be Brodie módszere szerint, a peteíészek-aromatáz aktivitásának növelése céljából [A. M. H. Brodie és szerzőtársai, Steroids, 38, 693, (1981)], szubkután injekció formájában. A második PMSG-dózis beadása után 3 nappal a kísérleti állatokból 6-os csoportokat alakítottunk ki és az egyes csoportokon belül valamennyi állatnak orálisan vagy csak vehikuliimot (0,5% mcfhocel), vagy inhibitort adtunk be; a dózis a későbbiekben közölt táblázatban szerepel. 24 óra múlva a kísérleti állatokat leöltük, petefészkeikből mikroszómákat izoláltunk és meghatároztuk ezeknek az aromatáz aktivitására kifejtett hatását. Az alkalmazott módszer hasonló volt ahhoz, melyet a fentiekben az in vitro aktivitás kiértékelésére már ismertettünk, de az inkubálást 30 percig végeztük 1 ml inkubációs térfogatban és ez az inkubációs közeg a kísérlet során 0,1 mg mikroszomális proteint, 100 nanomól 4 - [3H] - androszténdiont és 100 jimól NADPH-t tartalmazott. Az aromatáz aktivitásának gátlását százalékbari fejeztük ki a kontrollokhoz képest. Bár a találmány szerinti vegyületek a referencia vegyületekhez képest in vitro csupán azonos hatási vagy esetleg éppen gyengébb hatást mutattak, in vivo mégis sokkal hatásosabb aromatázgátiókna! bizonyultak az említett rcfcrenciavegyíileteknél. Az alábbi táblázat egyes találmány szerinti vegyüietek in vivo aktivitását mutatja be, jól ismeri: aromatáz-inhibitorokka! összehasonlítva. A találmány szerinti vegyületek a következők: 6a - azido - androszta - 1,4 - dién - 3,17 - dión (belső jele: FCE 24403) és 6a - amino - androszta - 1,4 - dién - 3,17 - dión (belső jele: FCE 24968). Az összehasonlításhoz használt Ismert aromatázgátló k: 4 - hidroxi - androszt - 4 - én - 3,17 - dión (4— OH-A) G 97 028 5 10 15 2C 2f. 3íi 3b 40 45 50 55 60 65
