196915. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés oldatban lévő egy vagy több komponens elkülönítésére kromatográfiás úton
5 196 915 6 ban akkor előnyös használni, amikor az eluens és az oszlop alján elhelyezett, a tömítőelcm szerepét betöltő körgyűrű érintkezését mellőzni kell. A találmány szerinti eljárás sikeresen alkalmazható a kromatográfia különféle területein, így a kovasvgél-kromatográfiában, a fordított fázisú folyadékkromotagráfiában, a kapilláris-kromatográfiában, az affinitás-kromatográfiában, a kromato-fokuszálásban, a méret szerinti kizárásos kromatográfiában — más néven gélszűrésben — és az ioncserélő kromatográfiában. A kovasavgél-kromatográfia az egyik legáltalánosabb kromatográfiás eljárás. A kovasavgél meszsze az egyik legjobb ismert adszorbens, amely viszonylag olcsó más anyagokhoz hasonlítva. A találmány szerinti eljárásban a koyasavgéllel kapott elválasztási eredmények — ami az elválasztás pontosságát és a kitermelést illeti — lényegileg azonosak vagy jobbak, mint a hagyományos eljárásokkal kapott eredmények, de a találmány szerinti eljárás kényelmesebb, mivel gyorsabb és kevesebb oldószerre van szükség. A találmány szerinti eljárásnak még az a különleges előnye van, hogy az oszlop újra felhasználható, továbbá kisebb méretű kovasavgél szemcséket és tömörebb töltést lehet alkalmazni, ennek eredménye a jobb elválasztás. A fordított fázisú folyadékkromatográfiát az jellemzi, hogy az álló fázis kevésbé poláris, mint a mozgó fázis. Ennek fő hátránya a kovasavgél-kromatográfiával összehasonlítva az, hogy az ilyen ágyán átvezetett vegyületeknek csak egy része különíthető el. A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia előnyeit kihasználva, a fordított fázisú folyadékkromatográfia is sikeresen alkalmazható a preparatív kormatográfiában. Újabban a kapilláris-kromatográfia nagyobb jelentőségre tett szert, elsősorban a nagyteljesítményű folyadékkromatográfiához kifejlesztett mikrooszlopok tekintetében. Ezek kifejlesztésének oka a kapilláris-kromatográfia következő előnyeiben rejlik: a) megvalósítható komplex keverékek jobb hatásfokú szétválasztása és az oldott anyagok éles elválasztása, b) a felhasznált eluens mennyiség lényegesen csökken. A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás eljárás könnyen alkalmazható a kapilláris-kromatográfiához úgy, hogy az ismertetett oszlopot vékony csatornával látjuk el. A gélszűrés — ami méret-kizáró kromatográfia néven is ismert — egyre nagyobb érdeklődésre tesz szert biológiai anyagok tisztításánál, elválasztó közegként megfelelő adszorbenst használva. Jó eredményeket értünk el jelzett jódot tartalmazó hCG-oldatból a jelzett jód elválasztásánál, Sephadex G-típusú adszorbenst használva (Pharmacia Fine Chemicals, Sweeden), a találmány szerinti mozgó-oszlopos kromatográfiát alkalmazva (3. példa). A gélszűréses kromatográfia egyszerű és gyors módszer pufferok sómentesítésére vagy átalakítására. A gélágyat a kísérlet előtt egyensúlyba kell hozni egy megfelelő ionösszetételű oldattal, sómentesftés esetében például desztillált vízzel. Az eluálást ugyanezzel a folyadékkal végezzük. Az alkalmazható nagy sebességek következtében az egész eljárás rövid idő alatt elvégezhető, a só mentesített anyagot néhány perc alatt kapjuk. Más területei a gélszűréses kromatográfiának a dinamikus kromatográfia alkalmazását tekintve, a nagyteljesítményű folyadékkromatográfiánál végzett előkezelés, majd az elválasztás után a híg minták koncentrálása. A kromato-fokuszálást széles körben használják proteinek szétválasztására, izoelektromos pontjaik szerint. Mivel a kromato-fokuszálásnál az elválasztandó anyagnak igen keskeny sávjait kapjuk és az eljárás általában hosszú, szűk keskeny oszlopokat igényel, a mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia vékony oszlopot alkalmazva ideálisnak látszik erre a célra. A mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia alkalmazható a jól ismert, széleskörben alkalmazott ioncserélő kromatográfiához is. Számos kísérletet végeztünk réz-szulfát és nátrium-bikromát szétválasztására Dowex 50 WX 8 adszorbensen (2. példa). Azt találtuk, hogy a mozgó-oszlopos folyadékkromatográiia alkalmazása igen előnyös az időtartam, az oldószer-térfogat és a kényelmes kivitelezés szempontjából. A találmány szerinti mozgó-oszlopos folyadékkromatográfia alkalmazásával a holttérfogat lényegesen csökken. Mint ismeretes, a holttérfogat (hézagtérfogat) a folyadéknak az a térfogata, amely az ágy adszorbens szemcséi közötti teret foglalja el. A legtöbb hagyományos kromatográfiás eljárásban a pontos eredménymeghatározás szempontjából a holttérfogat problémát jelent. A mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiánál, mivel az oszlop tömör lehet az anyag egyensúlyi megoszlása az adszorbens és a folyadék között igen gyorsan beáll, igen kis holttérfogattal. Ennek megfelelően éles és keskeny zónákat kapunk. Ez igen fontos a frakcionáló kísérletekben, ahol az anyagok között eluált térfogatok különbsége általában kicsi. Kiváltképpen a gélszűrésnél rontja le a nagy holttérfogat a kapott eredményt. Az 1. ábra szerint nz 1 tartály fel van szerelve egy Luer féle 9 zárószerkezettel, amelyhez egy háromágú 3 szelep csatlakozik. A szükséges 4 eluenst az 1 tartályba kényszerítjük. Az 5 oszlop üreges, amelyben a 6 adszorbens van elhelyezve, ezt az oszlop tetején és alján két 7 és 8 határolódéin, előnyösen tartja. A felső 8 határolóelem felett egy 2 záróelem van egy 10 kivezetőnyflással, amelyen keresztül az elválasztott frakciót az adszorbens-ágyról eltávolítjuk. Az oszlop alsó részén van egy 11 tömítőelem, amely úgy van az 5 oszlophoz illesztve, hogy az 1 tartály belső fala mentén csússzon. A 4 eluenst tartalmazó 1 tartály alján egy- vagy többágú 3 szelep helyezhető el. A többágú 3 szelep használata igen fontos, ha egymást követően több eluenst kell bevezetni az 1 tartályba, amelyeket a 6 adszorbens ágyon vezetünk tovább, és így jön létre a szükséges frakcionálódás. Ha a 6 adszorbenst főleg egy minta előkezelésére vagy egy vegyüld elkülönítésére használjuk, akkor a 3 szelep alkalmazása nem feltétlenül szükséges, hanem használható egy egyszerű 1 tartály is, amelynek alsó része zárt és amelybe az 5 oszlop beleillik. Ebben az esetben a 4 eluenst még az 5 oszlop betolása előtt kell az 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
