196844. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligomicin-komplex és komponensei előállítására fermentációs úton
1 2 aerob körülmények között fermentáljuk, majd a kapott fermcntléből ismert módon elkülönítjük az oligomicin-komplexet vagy komponenseit. A fermentációhoz használt Süeptomyces diastatochromogenes var. RO-31 mikroorganizmus törzset úgy alakítjuk ki, hogy Streptomyces diastatochromogenes var. 0-3míkroorganizmust 0,08 0,2 M (1 -2 tömegé) foszfát-aniont tartalmazó szilárd táptalajon széiesztünk, a túlélő egyedeket legalább három egymást követő esetben ugyanezen táptalajra átoltjuk, majd az így kapott izolátumok termelőképességét rázott kultúrákban ellenőrizzük, és a 900 /rg/ml-nél nagyobb aktivitású mikroorganizmusokat kiválasztjuk. F.lőnyösen úgy járunk el, hogy az ismert Streptomyces diasztatochromogenes var. 0-3 törzs spóráiból steril fiziológiás nátrium-klorid oldattal szuszpenziót készítünk. A légmicéliumok és a táptalajtörmelékek eltávolítása céljából a szuszpenzóit szűrjük, majd homogenizáljuk, ezután steril fiziológiás nátrium-klorid oldattal hígításokat végzünk. A hígított spóraszuszpenziót növekvő mennyiségű foszfátot tartalmazó élesztő, húskivonat, tripton, vas-szulfát, glükóz-tartalmú agarra szélesztjük, majd inkubáljuk. Az inkubációs idő letelte után a fentivel azonos összetételű táptalajból készült ferde agarra oltjuk a legtöbb foszfátot tartalmazó tenyészetek egy-egy telepét, majd a szükséges ideig inkubáljuk a leoltásokat. A párhuzamos leoltásokból szerves nitrogén- és szénforrást, továbbá szervetlen sókat tartalmazó, 300 ml térfogatú Erlenmeyer lombikban sterilezett 50 ml táptalajokat oltunk, a párhuzamos leoltású ferde agar tenyészeteket pedig felhasználásig +5 "C-on tároljuk. A tenyésztést rázóasztalon 28 °C hőmérsékleten végezzük 5 napon keresztül. Ekkor a tenyészet oligomicin-tartalma 980 Atg/ml. A tenyészlevek hatóanyag-tartalmát agardiffuziós biológiai értékméréssel határozzuk meg. Tesztorganizmusként Aspergillus niger törzsét használunk. A tenyészleveket ismert módon - például a 927 057 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közöltek szerint — dolgozzuk fel. A találmány szerinti eljárás előnyeit az alábbiakban foglalhatjuk össze: 1) A találmány ipari méretekben egyszerűen megvalósítható, kitűnően reprodukálható, gazdaságos antibiotikum termelést biztosít. 2) A találmány alkalmazásával a nagy antibiotikum-tartalmú fennentlé előállításához nincs szükség a rendkívül nagyszámú és munkaigényes törzsszelekciós és -nemesítési kísérletek elvégzésére. 3) A találmány szerinti eljárással az eddig ismertnél lényegesen nagyobb antibiotikum-koncentrációjú fermentlé állítható elő, a felhasznált mikroorganizmus nagy termelőképessége hosszú időn át ellenőrizhető módon megmarad. 4) A találmány szerinti eljárással kapott fermentlé nagy antibiotikum-tartalma miatt egyszerűbben és gazdaságosabban folgozható fel, mint a korábbi eljárásokban . A találmány szerinti eljárást az alábbi példán mutatjuk be. Példa a) Streptomyces diastatochromatogenes var RO-31 törzs előállítása: Streptomyces diastatochromatogenes var. 0-3 fiziológiás nátrium-klorid oldattal készült, milliliterenként 107 - 5xl07 életképes spórát tartalmazó spóraszuszpenzióját a következő összetételű, Petri-csészékbe öntött szilárd táptalajra (jele: I) szélesztjük: Élesztőkivonat (Oxoid gyártmány) 0,1% Húskivonat (Oxoid gyártmány) 0,1% Tripton 0,2% Vas(ll)-szulfát 0,00003% Glükóz 1,0% Agar 2,0% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,0-ra állítjuk be. Sterilezés után a még forró táptalajhoz adagoljuk a külön sterilezett foszfátpuffert, amely a következő módon készül: I mólos KH2PO4 — és 1 mólos Na2HPO* -oldatot elegyítünk úgy, hogy a puffer műszerrel ellenőrzött plí-ja sterilezés előtt 7 legyen. Ezt az oldatot sterilezzük, majd a forró agaros táptalajhoz adagoljuk. Ezzel az eljárással a következő foszfát-koncentrációjú táptalajokat készítjük el: 0,01 M, 0,02 M, 0,05 M, 0,2 M,0,5 M, kontroll. A megszilárdult táptalajra szélesztjük a Streptomyces diastatochromatogenes var. 0-3 spóraszuszpenzlóját, majd 28 °C-on 5 7 napig inkubáljuk. A jól fejlett telepeket a fentivel azonos összetételű ferde agarra oltjuk, majd 5 7 napig inkubáljuk. A kinőtt tenyészetek átoltását még két alkalommal megismételjük a fenti eljárással. Az ezután kapott 44 ferde agarra oltott izolátumok egy-egy példányával 300 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 50 ml következő összetételű táptalajt (jele: II) oltunk: Mogyoróliszt 1% Hidrolizált kazein (l0%)-os) 1% Nátrium-klorid 0,45% Kalcium-karbonát 0,5% Glükóz (külön sterilezve) 3,0% A táptalaj pH-ját szükség esetén nátriurrvhidroxid oldattal 7,0-re állítjuk, majd 20 percig 121 °C-on autoklávban sterilezzük. Oltás után 28^C hőmérsékleten, körkörös irányban 6 cm-es kitéréssel mozgó rázóasztalon inkubáljuk a tenyészeteket, majd 96 és 120 órás korban sterilen mintát veszünk biológiai értékmérésre. Az eredményeket a II. táblázatban közöljük. A II. táblázatban M mól-koncentrációt jelent. A II. táblázatban közölt adatok 120 órás korban vett mintára vonatkoznak, A 0,2 M foszfát-tartalmú táptalajról mind a 4 telepet izoláltuk, az ennél kisebb foszfát-tartalmú táptalajokról véletlenszerűen izoláltunk telepeket. II. táblázat Táptalaj foszfáttartalma (M) Kinőtt Izolált telepek telepek száma száma Átlagos termelés Mg/ml Maximális termelés ml ml 0 3 x 107 36 200 280 0,01 2 x 107 34 230 280 0,02 4 x 104 46 350 420 0,05 3 x 103 52 680 760 0,2 4x10° 4 980 1200 0,5 0 0 0 0 196.844 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
