196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 száriak kifejezésére, függ a felhasználható kifejeződő vektor hozzáférhetőségétől, a jó kitermelést biztosító, az információt kifejező gazdasejttől és függ, hogy rendelkezünk-e olyan gazdasejttel, amely képes felismerni például a s/ekretálást biztosító jeleket , hogy biztosítható legyen a vezető szekvencia le hasítása. Így minden helyzetben és minden egyes idiotípus esetén meg kell állapítanunk a változó és ezen túlmenő régiókat meghatározó DNS-szekvencia legalább egy részének restrikciós térképet. Ha a vektor végei és a beépítendő szekvencia végei hasonlóak, meg kell vizsgálnunk, hogy az adott szekvencia jó, azaz nem rossz orientációban épült be. A beépítést követően kapott klónozott plazmidok térképezésével kiválaszthatjuk azt a plazmidot, amely a változó szakaszt meghatározó szekvenciát megfelelő orientációban tartalmazza. A fenti stratégia több fontos előnnyel jár. A polipeptid láncokat azonos szekvenicákat és azonos lánchosszúságú szálakat tartalmazó homogén készítményként kapjuk. Az rl v-t alkotó polipeptidek cukormentesek és ezért, további homogenitásuk,miatt egységesen jelezhet ők vagy módosíthatók. így a terméket egységes és reprodukálható tulajdonságú anyagként kapjuk meg. A termék emlősnek megbízhatóan adagolható és viszonylag enyhe melléktúneteket vált ki, amelyek heterogén termék adagolásakor jelentkezhetnek. Az alábbiakban az eljárás az oltalmi kör korlátozása nélkül, példában szemléltetjük. A példában jellemző ligandként a dinitro-fenilt adjuk meg. A találmány szerinti eljárást természetesen bármely ligandra felhasználhatjuk, bár a szóba jövő idiotípusok nagy száma miatt az eljárás bizonyos szakaszait egy adott restrikciós hely vagy más jellemzők miatt részben módosítanunk kell. Példa A dinitro-fenil (DNP) monoklónozott antitestjeinek előállítása 10,5 pH-jú vizes pufféiban 10 mM 2,4-dinitro-benzol-szulfonátot oldunk (lásd Eisen és munkatársai, J.A.C.S., 75,4583, 1953) és az oldathoz 0,01 mM hemocianint adunk, majd 20 órán át szobahőmérsékleten rázzuk az elegyet. Ezt követően 0,6 M nátrium-klorid oldattal szemben többször dializáljuk, az oldatot és a maradékot immunizálásra elkülönítjük. 100 jug így előállított DNP immunogént 0,1 ml komplett vagy inkomplett Freund-adjuvánssal és 0,1 ml per dózis mennyiségű PEs-sel (polietilén-nátrium-szulfonát) keverjük. Hat BALB/c egeret injektálunk egy-egy dózissal, hetenkénti adagolással, az injekciókat intraperitoneálisan és szubkután adjuk a talpba és az inguinális területre. Az első injekciót komplett, a többi hármat inkomplett Freund-adjuvánssal adjuk. Az utolsó injekciót követő harmadik napon leöljük az egereket, izoláljuk a lépet és monoklónozott antitestek képzésére használjuk fel. A fúziót úgy végezzük, hogy 3xlQ7 Sp2fO-Agl4 míleloina sejtet (Shulman és munkatársai, Nature, 276, 269-270, 1978) és 5x107 lépsejtet egyesítünk és a sejtszuszpenziót 5 percen át 200 g-n centrifugáljuk, majd óvatosan 0,6 ml 50%-os polietilén-glikol 1500 oldatban (az oldatot Dulbecco módosított Eagle-táptalajával készítjük. Flow) újra szuszpendáljuk. 1 perc múlva 20 ml, 37 C hőmérsékletű R táptalaj adunk (RPMI 1640 táptalaj, Gibco, amit 30 mM Hepes oldattal, Flow, egészítünk ki). Centrifugáljuk a sejteket és 20 ml R táptalajban szuszpendáljuk, amit előzőleg 10% borjú szérummal (Gibco) (RF táptalaj) egészítünk ki. 0,2 0,2 ml sejtszuszpenziót 0,8 ml RF táptalajt tartalmazó, 200 db csövecskébe mérünk. 100 db csövecske 2xl05 egér peritoneális sejtet is tartalmaz. 24 órán át inkubáljuk a sejteket, majd mindegyik csövecskébe 1 ml, HAT táptalajjal kiegészített RF táptalajt mérünk. Minden 2-3. napon 1 ml táptalajt friss RF*GAT táptalajjal cserélünk ki. Két hét múlva a növekvő sejteket immunglobulin termelésre vizsgáljuk, a vizsgálatot 35 S-2,4-dinitro-fenil-szulfonamid-lizinnel végezzük. A sepcifikus aktivitást adó kiónokat lágyagaron klónozzuk anti-DNP előállítására. Eljárhatunk Herzenberg és munkatársai módszere szerint is (J. Hxp. Med., 151. 1071-1087, 1980). E szerint a DNP-szubsz.tituált marha szérum albumint Rí A hígítóval (1% BSA, 0,005 M EDTA és 0,1% NaN3 7,6 plf-jti PBS-ben) adagolunk a mikrolemez csövecskéibe, és 1 órán át inkubáljuk a lemezt, majd vizsgálandó és standard antiszérumot adunk a csövecskékhez, megfelelő hígítás után (20 pl/cső) és I órán át folytatjuk az inkubálást. Háromszor RIA hígítóval mossuk a lemezeket, majd 1 75 [ jelzett anti-egér immunglobulint adagolunk 2x10* cpm/cső mennyiségben és I órán át ínkubálunk. Ezután háromszor RIA hígítóval mossuk a lemezeket, szárítjuk és autoradiografiát végzünk. Az antitestek detektálására mindkét fenti módszer jól ismert. Ezután klónozzuk a sejteket, vagy hígítást követően vagy lágyagaron és a klónozott sejtvonalakat szaporítjuk és folyékony nitrogén alatt fagyasztva tároljuk felhasználásig. Egy liter tenyészetet készítünk egy pozitív klónozott sejt vonalból, a tenyészet milliliterenként lxlO6 sejtet tartalmaz. Centrifugálással összegyűjtjük a sejteket, majd 1 g-ot 16 ml guanidium-tiocianát törzsoldatban (4 M, 50 g guanidium-tiocianát, 0,5 g nátrium-N-lauril-szarkozinát, 2,5 ml 1M nátrium-citrát, pH 7,0, 0,7 ml 2-merkapto-etanol és 0,5 ml 30%-os Antifoam A (Sigma) keverése után az oldatot 100 ml-re töltjük fel) szuszpendálunk, a szuszpenziót 55 ml-es Potter-Elvehjen homogenizátorba töltjük és 30 60 másodpercen át homogenizáljuk teljes fordulatszámon, 18 mm átmérőjű Tissumizer homogenizálóban (Tekniar-Industries). A kapott homogenizátumot 10 percen át percenkénti 8000-es fordulattal centrifugáljuk, 10 °C hőmérsékleten Sorval HB4 lengő rotorban. A felülűszót lombikba töltjük, 0,024 térfogat (a homogenizáló puffer eredeti térfogatára számítva) I M ecetsavval keverjük a 7-es pH 5-re csökkentésére, majd 0,75 térfogat vízmentes etanolt adagolunk. Lezárjuk a lombikot és erőteljesen rázzuk, majd egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten tároljuk. Ezután 10 percen át -10 °C hőmérsékleten 6000 fordulatszám/perccel centrifugáljuk HB4 rotorban a termék elkülönítésére. A csapadékot elkülönítjük és erőteljes rázás közben 0,5 térfogat pufferolt guanidin-hidrogén-klorid törzsoldatban (7,5 M, semlegesített, majd 0,25 térfogat 1 M nátrium-citráttal pufferolt oldat, pH 7,0, 5 mM ditio-treitol) szuszpendáljuk. 68 °C hőmérsékletű vízfürdőben rövid időn át melegítjük a szuszpenziót, amikor diszperziót kapunk. 0,025 térfogat (guao 96.842 5 10 15 20 25 30 35 4G 45 50 55 60
