196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
1 2 196 832 galombaa levő, nagyon tiszta sűrítményét (AHF Cutter Laboratories, Inc.), inkubáliuk a sejtmentes felülúszók és a feltárt sejtek fiziológiás sóoldatban (0,9 % nátrium-klorid) került szuszpenzió mintában. Az inkubálás előtt a száraz Vlll-as faktort steril vízben oldjuk 240 egység/10 ml oldat koncentrációban. A forgatott tenyészet feltárt sejtjeiből hasonló mintát készítünk, külső VHI-as faktor hozzáadása nélkül (Z minta). A példában szereplő öt minta a következő: V minta — feltárt sejtek a T-lombik tenyé~ szetéből, W minta - sejtmentes felülúszó a T-lombík tenyészetéből, X minta — feltárt sejtek a forgatott tenyészetből, Y minta — sejtmentes felülúszó a forgatott tenyészetből, és Z minta — feltárt sejtek a forgatott tenyészetből, t = Az összegyűjtött frissen fagyasztott plazma hideg oldhatatlan frakciójából tisztítva, a Hershgold és munkatársai (J. Lab. Clin. Med., 67, 23-32 /1966/) által leírt módszerek módosításával és finomításával. A feloldott VÍIl-as faktort részletekben ínkubáljuk a következők szerint: 10 ml (240 egység) VIIf-as faktort keverünk 100 ml, a V mintából származó feltárt sejtek szuszpenziójával 90 ml normál sóoldatban és egy ml Aprotinin proteáz inhibitorral: 10 ml (240 egység) VIIl-as faktort adunk 190 ml a W mintából származó sejtmentes felülúszóhoz és egy ml Aprotinin proteáz-gátlóhoz, 10 ml (240 egység) VIIf-as faktort keverünk 15 ml, az X mintából származó feltárt sejtek szuszpenziójához 173 ml normál sóoldatban: 9,5 ml (228 egység) VIIl-as faktort adunk 191, az Y mintából származó sejtmentes felülúszóhoz. 15 ml a Z mintából származó feltárt sejtet adunk 185 ml normál sóoldathoz, külső VIIl-as faktor hozzáadása nélkül. Az elválasztási eljárást a következőképpen hajtjuk végre: Az X és Z minták esetében a mintákat először 70,0 mg B gyantával (lásd 2. példa) keverjük össze, a pM-t 8,0 -ra állítjuk és a szuszpenziót 20 percig ezen a pH-n kevertetjük. A keveréket Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük keresztül. A gyantát desztillált vízzel egy főzőpohárban mossuk a szűrőpapírról és 5 percig keverjük. Ezt a keveréket Büchner tölcséren Whatman 8 szűrőpapíron szűrjük át. A gyantát eldobjuk és a két szürletet egyesítjük. A szürletctek térfogatát feljegyezzük és a szürletet ugyanúgy vizsgáljuk, mint a B gyantán nem adszorbeált frakciót. A V, W és Y mintákat (B gyantával nem kezelt), valamint a fentiek szerint kezelt X és Z mintákat (B- gyantával való kezelés után nyert szőrietek) előre kondicionált A gyantával (lásd 1. példa kezeljük az alábbiak szerint: A mintát és a gyantát összekeverjük, a pH-t 5,8- ra állítjuk és a kapott szuszpenziót 20 percig keverjük ezen a pll-n. A szuszpenziót Büchner tölcséren Whatman 54 papíron szűrjük meg. Mielőtt a lepény kiszárad és fnegreped, a szürlet térfogatát feljegyezzük, mintát veszünk belőle és ugyanúgy vizsgáljuk, 5 mint az A gyantán nem adszorbeált frakciót, majd 200 ml, 0,1% BSA-t tartalmazó 0,002 mólos nátrium-klorid-oldatot öntünk a lepényre és a teljes szürletet elöntjük. A lepényt 200 ml, 0,1% BSA -t tartalmazó 0,3 mólos nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk és 5 percig pH 5,8-on keverjük. A 1szürletet Büchner tölcséren Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük meg. Mielőtt a lepény megszárad és megreped, a szürlet térfogatát feljegyezzük, mintát veszünk belőle, mint a mosó-folyadékból, majd 200 ml, 0, l% BSA-t tartalmazó 0,3 mólos nátrium-klo- 15 rid-oldatot öntünk a lepényre és a teljes szürfetet elöntjük. A gyanta-lepényt 200 ml, 1,5 mólnátrium-klorid, 0,1 mól lizin és 0,01 mól nátrium-citrát, 0,1% BSA összetételű vizes eluáló oldatban szuszpendáljuk, majd 20 percig pH 6-on kevertetjük. A szuszpenziót Büchner tölcséren Whatman 54 20 papíron szűrjük. A gyanta-lepényt eldobjuk és a kapott szürletet újra szűrjük Büchner tölcséren Whatman 1 szűrőpapíron keresztül. A szürlet térfogatát feljegyezzük és mintát veszünk belőle vizsgálat céljából, mint a végső VHI-as faktor frakcióból. A VIIl-as faktor méréseket az ilyen újra kezelt 25 mintákon ugyanúgy végezzük, mint az 1. példában, és az eredményeket kinyert VIIl-as faktor ességekben fejezzük ki. Az eredményeket a következő III. Táblázat-ban közöljük. 30 35 40 45 50 III. táblázat Vizsgált minta VIIl-as faktor aktivitás-egység V W X Y Y Z min ta min ta min ta min ta min tanún ta Feltárt sejtek^ Feltárt sejtek* VIIl-as faktor Sejtmentes felülúszó Sejtmentes felülúszó + VIIl-as faktor B gyanta adszorbeálat- Ian anyag A gyanta adszorbeálatlan anyag Mosófolyadék Végső eluált VIIl-as faktor 93 198 198 300 0 602 3 240 375 228 104 6 1 3 2 3 3 2 3 5 2 100 208 172 190 39 Az eredmények a VHI-as faktor-aktivitás kinyerését mutatják májsejt-tenyésze lekből. 4. példa Lényegében az 1 -3. példákban leírtakhoz ha- 55 sonló eredményeket kapunk, ha ekvivalens mennyiségű propilénnel vagy izobutilénnel helyettesítjük az etilént, és/vagy ekvivalens mennyiségű citrakonsav, itakonsav vagy akonitsav anhidriddel helyettesítjük a maleinsav-anhidridct és/vagy ha az említett 1-3 példákban ekvivalens mennyiségű dietil-amino-etil- 60 aminnal helyettesítjük a dimetilaminpropilamint. 9
