196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
1 2 Kereskedelmi forgalomban lévő, nagyon' tiszta humán VIII-as plazma-faktort (Hemofil1' AHF*, (A 3 415 804, 3 631 018, 4 089 944 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban és Re. 29 698-ban közölt módszer szerint előállítva), Travenol Laboratories Inc.) feloldunk 10 ml steril vízben majd a fenti sejtmentes felülúszókban valamint a fenti feltárt sejtekből fiziológiás sóoldattal készített szuszpenzióban 30-190 ml hígításban inkubáljuk, A VII 1-as faktort ezután a megfelelő szuszpenziókból adszorpcióval nyeljük ki a következő vízben oldhatatlan, térhálósított polielektrolit polimer gyantával (A gyanta). Az A gyanta 5 mól dimetil-amino-propil-imid csoportot tartalmazó, 5 mól% metilimino-bisz(propilanún)nal térhálósított, lényegében ekvimoláris mennyiségű etilént és maleinsav-anhidridet tartalmazó kopolimer. Az összes szabad karboxii vagy a anhidrid-csoportot tovább blokkoljuk metoxi-propilaminnal. Ezt a polielektrolit kopolimert lényegében az 1. példában leírt módon, a 4 157 431 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közölt módszerrel készítettük a reagenseket és mólarányokat illetően. Felhasználás előtt az A gyantát a következőképpen készítjük elő: Tizenkét gramm A gyantát keverünk 200 ml stabilizálóként 0,1% szarvasmarha szérum-albumint (BSA) tartalmazó 0,154 mólos nátrium-klorid-oldatban. (Humán szérum-albumint is használhatunk BSA helyett). A píl-t 4,0-ra állítjuk 1 mólos citromsavval, majd a szuszpenziót műanyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük keresztül. A szürletet elöntjük és a polielektrolit polimer szűrési maradékot 200 ml, 0,1% BSA-t tartalmazó, 0,154 mólos nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk. A pH-t ezután 1 normál nátrium-hidroxiddal 5,8-ra állítjuk, majd tíz percig pH 5,8-on kevertetjük. A szuszpenziót ismét m(anyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük. A szürletet elöntjük és a polielektrolit polimer szűrési maradékot megőrizzük az alább következő felhasználásra. Az elválasztási eljárást a következőképpen hajtjuk végre: / A protinin proteáz inhibitort (Sigma Chemical Company) (egy ml, 10—20 tripszin-inhibitor egység) adunk stabilizálóként 190 ml, a fentiek szerint előállított E. coli tenyészet felülúszójához műanyag főzőpohárban. 3—5 perc keverés után 10 ml feloldott Hemofil AHF-t (264 egység VIII-as faktor) adunk hozzá, az elegyet keverjük és vizsgálat céljára mintát veszünk belőle (a minta) a kezdeti szint megállapítása céljából. Az elegyet a fentiekben megőrzött polielektrolit polimer szűrési maradékhoz adjuk, a pH-t 1 mólos citromsavval 5,8-ra állítjuk és 20 percig pH 5,8-ra kevertetjük. A szuszpenziót műanyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük át. Mielőtt a polielektrolit lepény megszárad és megreped, a szürlet térfogatát megmérjük és mintát veszünk (b minta). 200 ml, 0,1% BSA-t tartalmazó 0,002 mólos nátrium-kloridot öntünk lassan a polielektrolit lepényre. A szürletet elöntjük, a lepényt szuszpendáljuk 200 ml, 0,1% BSA tartalmú 0,3 mólos nátrium-klorid-oldatban, majd pH 5,8 mellett öt percig keverjük. A szürletet műanyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük keresztül. Mielőtt a polielektrolit polimer lepény megszárad és megreped, a szürlet térfogatát megmérjük és mintát veszünk belőle (c minta). 200 ml, 0,1% BSA tartalmú 0,3 mólos nátrium-klorid-oldat tál mossuk a polielektrolit polimer lepényt és a szürletet elöntjük. A polielektrolit lepényt ezután 200 ml 1,5 mól nátrium-klorid, 0,1 mól lizin és 0,1 % BSA stabilizátor összetételű oldatban diszpergáljuk, a pH-t 1 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 6,0-ra állítjuk, majd pH 6,0 mellett a szuszpenziót 20 percig keverjük. A szuszpenziót műanyag Büchner tölcséren, Whatman 54 szűrőpapíron szűrjük át. A polielektrolit polimer lepényt eldobjuk és a szürletet újra szűrjük műanyag Böchner tölcséren Whatman 1 szűrőpapíron keresztül. A kapott szürlet térfogatát megmérjük és vizsgálat céljára mintát veszünk belőle. A fenti polielektrolit adszorpciós eljárást megismételjük a fenti élesztő-tenyészet sejtmentes felülúszójával valamint a fenti E. coli és élesztő feltárt sejtszuszpenziókkal. A VIII-as faktor vizsgálatokat a fentiekben kivett mintákon az ismert egy-lépéses aktivált PTT (részleges tromboplasztin idő) vizsgáló módszerrel (További háttér-információ az egy-lépéses PTT vizsgáló módszerről, lásd (Quick, „Hemorrhagic Diseases” Lea and Febiger Philadelphia, Pa., 1957, Langdell et al., J. Lab. Clin. Med. 41.637 (1953) és Hardisty et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 7. 215 (1962). MLA Electra 750 Coagulation Timer-rel (Medical Laboratory Automation, Inc.) végeztük. Ez a berendezés optikai érzékelőt használ az alvadási folyamat megkezdődésének jelzésére. A koagulációs sebesség második differenciálhányadosát méri (azaz a koagulációs sebesség változásának sebességét). A mérést APTT (aktivált részeges tromboplasztin idő) reagens készlettel (Acthi) és a kereskedelmi forgalomban Dadi Diagnostics, Inc. által eladott eljárással végezzük, mely VIII-as faktor hiányos plazmát és ellagin-sav aktivátort tartalmaz (3 486 981 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás). A koagulációs időket meghatározzuk a vizsgált minták említett hígítására és az eredményeket kinyert VIII-as faktor egységekben, valamint az eredeti kezeletlen minta (a minta) aktivitására vonatkoztatott, kinyert VIII-as faktor aktivitás százalékában fejezzük ki. Az eredményt a következő I. táblázatban közöljük: I. táblázat Mikrobiális VIII-as faktor aktivitás (egység/kiindulási szint %) Adszorbeá- VIII-as fák- Kinyert latlan VIII- tor aktivi- VIII-as as faktor tás a mosás faktor aktiaktivitás mintában vitás ad a b mintá- (s) mintában ________________han_______________________ E. coli sejtmentes felülúszó 0,5/0,2% 0,7/0,3% 181/68.6% E. coli feltárt sejt szuszpenzió 0,8/0,3% 0,6/0,2% 135/61.1% 196 832 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
