196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
1 2 ridekre jellemző példa a maleinsav, citrakonsav, itakonsav, akonitsav vagy ezek anhidridjel. Ezek közül a monomer komponensek közül az etilén és a maleinsav-anhidrid használhatók előnyösen kopolimer képzésére. A kopolimer előnyösen lényegében ekvimoláris mennyiséget tartalmaz a két monomer komponensből. A kopolimercknek víz-oldhatatlanság céljából végzett térhálósitásál ismert térhálósító anyagokkal végezlietjük, úgymint divinil-benzollal és etilén-diaminnal. Az előnyösen használható térhálósító anyagok a (kis szénatomszámú a!kil)-imino-bisz-(kis szénatomszámú)-alkilaminok, ahol kis szénatomszámű alkil jelen• tése ugyanaz, mint a fentiekben. A jelen szabadalmi leírásban használt polielektrolit kopolimerck ismert vegyületek, a 3 554 985, 3 55 001, 4 081 432, 4 097 473, 4 U 8 554 és 4 157 431 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban közölt módszerekkel állíthatók elő. Például az etilén- és malinsav anhidrid előnyösen használható kopolimerc (HMA) etilén és maleinsav-anhidrid reakciójával állítható elő peroxid katalizátor jelenlétében, megfelelő szerves oldószeres közegben. A kapott alap EMA kopolimert reagáltathajtjuk térhálósító anyaggal, például (kis szénatomszámú alkil)-imino-blsz(/kís szénalomszámú alkil/-amin)-nal, melynek két primer amino-csoportja van és térhálós EMA kopolimert eredményez. Az EMA-t előnyösen körülbelül 3-7 mólszázalék térhálósító anyaggal reagáltatjuk. A ki-, vánt di-(kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-amid) függelék funkciós csoportokat a térhálós kopolimerbe úgy juttatjuk be, hogy a di-(kis szénalomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-imid)-dei reagáltatjuk az EMA kopolimer megmaradt szabad anhidrid csoportjait, vagy azok egy részét. A jelen szabadalmi leírásban alkalmazott polielektrolit kopolimer adszorbensek készítése során körülbelül 3-100 mólszázalék di-(kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-amin)-t használunk. Egy előnyösen használható di-(kis szénatomszámú alkil-amino-kis szénatomszámú alkil-amin) a dimetilamino-propilamin és egy előnyösen használható térhálósító anyag a metilimino-bisz(propüamin). A polielektrolit kopolimereket előállíthatjuk a 4 118 554 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közölt aggregációs lépést használó módszerekkel, és minden megmaradó szabad karboxil vagy anhidrid csoportot alkoxi-alkilaminnal blokkolhatunk a 4 157 431 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közöltek szerint. Az említett alkoxi és alkil csoportok előnyösen 1-4 szénatomo sak, és a legelőnyösebben használható blokkoló csoport metoxi-propilamin. Érthető, hogy a polielektrolit kopolimer előállítási módszernek alábbi leírása csak ismertető jellegű és a plazmafehérjék sejttenyészet rendszerekből a jelen szabadalmi leírás alapján történő elkülönítési módszerét nem korlátozzuk egyes külön előállítási módszerekre. Jóllehet a polielektrolit kopolimerekről ismert, hogy jól használhatók vérszérum és plazma frakcionálására, eddig nem volt ismert róluk, hogy rendelkeznek mikrobiális sejttenyészetek fermentációs közegéről, emlős sejttenyészetek felhasznált tápközegéből, és más olyan, a plazma fehérjét különböző fehérjék, peptidek, nuklcinsavak és hasonló sejttenyészet komponensek keverékében tartalmazó komplex sejttenyészet rendszerekből a plazmafehérjék szeparálásának képességével. Amint a továbbiakban használjuk, a sejttenyészet rendszer kifejezés meghatározás szerint a tenyésztett sejtekből felszabadított anyagot jelent, úgymint például a sejtek lizátuma vagy extraktuma, vagy a fermentációs közegbe illetve felhasznált tápközegbe bevitt vagy ott feldolgozott anyagot, vagy ennek bármely olyan részében talált anyagot, mely a kívánt plazmafehérjét tartalmazhatja. A találmány szerinti eljárás alkalmazható a plazmában normális körülmények között bármely fehérje elválasztására a sejttenyészet rendszerből. Ezt részletes példákkal mutatjuk be az alábbiakban a vér koagulációs fehérje, nevezetesen a humán Vlll-as faktor elválasztásán bakteriális, élesztő és sejttenyészet rendszerekből és más plazmafehérjék, nevezetesen humán szérumalbumin elválasztásában bakteriális és élesztő sejttenycszet rendszerből. Más plazmafehétjék, úgymint például aj-antitripszin, cu-makroglobulin, fibronektin, coruloplazmin, C-reaktív fehérje, transzferrin, fibrinogén, protrombin, plazma tromboplasztin komponens és a gamma globulinok hasonló képpen választhatók el a találmány szerinti eljárással sejttenyészet rendszerekből. Ezeknek a plazmafehéijéknek a forrása a sejttenyészet rendszerekben lehet a tenyészlébe kívülről való bejuttatás, például a plazmafehérje növekedési faktorok bevitele, teljes vérszérum, úgymint ló, marha, vagy birka szérumok, vagy borjúmagzat szérum, tápanyagok és hasonlók, vagy származhatnak a plazmafehérjét specifikusan termelő génsebészetileg megváltoztatott sejtek tenyészetéből. A génsebészetileg megváltoztatott mikroorganizmusok esetében a kezdeti génsebészeti eljárás a következő négy, tipikus rekombináns DNS elemet alkalmazhajtja. f. A különböző forrásokból származó DNS molekulák hasítására és összekötésére szolgáló módszerek 2. egy mind önmagában, mind a hozzákapcsolt idegen DNS fragmenttel összekapcsolva szaporodni képes megfelelő gén-hordozó, 3. az összetett DNS molekulának működő baktérium vagy éfesztő-sejtbe való bejuttatására szolgáló módszerek, és 4. eljárás a rekombináns DNS molekulát befogadott sejtek kiónjának kiválasztására nagy sejtpopulációból Példaképpen egy baktérium-plazmid, például pSC-101 használható klónozó vektorként arra, hogy idegen vagy külső gént a gazda-baktériumban juttassunk. Egy jellemző gazda-baktérium lehet például az Escherichia coli K-l 2 1776, mely hozzáférhető az American Type Culture Collection-nál, Rockville, Maryland ATCC 31244 szám alatt. A plazmidot restrikciós endonuleázzal vagy más DNS-hasítóenzimmel hasíthatjuk, így egy intakt replikonnal és ragadós végekkel rendelkező lineáris DNS fragmentet hozunk létre. Egy második, a kívánt külső vagy idegen gént tartalmazó, adott fenotípust hordozó és komplementer, ligálható végekkel rendelkező DNS fragmentet nyerhetünk egy idegen sejtből, vagy kémiailag szintetizálhatjuk. Egy teljesen zárt, újra körré alakított plazmid előállítására ezt a második DNS fragmentet illesztjük az első fragmenthez DNS ligázzal vagy más DNS-t ligáló anyagokkal, például 7a dNS ligázzal. A második fragment beépítése a példaként felhozott plazmid EcoRI helyére, a genetikus információ kifejeződését a plazmid lac operon kontroll elemeinek ellenőrzése alá rendeli. 196 832 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
