196607. lajstromszámú szabadalom • Eljárás didezoxi-nukleozidok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
13 196 607 14 11. példa 6-(Metil-tio)-purin-9-(ß-D-2' ,3’-didezoxi-riboftiranozid) előállítása 1,2 g (7,2 mmól) 6-(metil-tio)-purint és 1 g (4,5 mmól) 2’,3’-didezoxi-timidint adunk 50 ml ionmentesített, 0,4 ml 1 mólos dikálium-hidrogén-foszfátot tartalmazó vízhez. így 7,7 pH értékű szuszpenziót kapunk, amelyhez 4450 NE timidin-foszforilázt és 1340 NE purin-nukleozid-foszforilázt adunk, majd a reakcióelegyet 37 °C hőmérsékleten 4 napon át keverjük, utána szűrjük, és a szűrletet -20 °C hőmérsékleten tartjuk. Felolvasztás után az oldatot szűrjük, és a szűrletet 5X90 cm méretű, P—2 gyantából készült oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 30 térfogat %-os vizes n-propanol-oldattal eluáljuk, a terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és hozzáadjuk az eredeti szűrőkalácsot. Az oldószer eltávolítása után kapott maradékot 30 térfogat %-os vizes metanololdatban feloldjuk, a Ph értékét tömény ammóniumhidroxiddnl 10,3-rn állítjuk, és az elegyet 2,5X8 cm méretű Dowcx 1-formiát oszlopon kromatografáljuk. A terméket 30 térfogat %-os vizes metanololdattal eluáljuk, vákuumban beszárítjuk, és a maradékot ismét 30 %-os n-propanolban oldjuk. Az így kapott oldatot 5X90 cm méretű P—2 gyantaoszlopon kromatografáljuk, és az eluálásra 30 %-os vizes n-propanolt alkalmazunk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószer eltávolítása után 0,405 g cím szerinti vegyülethez jutunk, olvadáspontja: 105 °C. Hozam: 21 %. ' Elemanalízis a CjjH^OjS összegképlet alapján: C% H % N % S% számított: 49,61 5,30 21,04 12,04 talált: 49,63 5,35 20,99 12,04 12. példa A vírus elleni (antivirálisj hatás vizsgálata a) A macska leukémia-vírusára kifejtett hatásvizsgálata Macska-embrióból származó tüdő-fíbroblasztokat (FLF-3) többmélyedéses lemezekre oltottunk (lemezenként 0,05 ml-t, 105 sejt/ml koncentrációban) Dulbecco szerint módosított Eagle-táptalajjal, és éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Ezt követően a 32 lemez mindegyikét 40-60 fókuszképzőegység macska-leukémia-vírussal fertőztük egy órán át, majd a közeget friss - fentiek szerint - táptalajjal helyettesítettük, amely változó koncentrációban 2,6 - díamino-purin - 9-((3-D-2’,3’-didezoxi-ribofuranozid)-ot tartalmazott. Ilyen oldatot 4 lemezre helyeztünk. E hatóanyagot 0, 1,0; 10, 50, 100, 200 és 400 mikromólos koncentrációban alkalmaztunk. Három napon át 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a tenyészeteken közvetett fluoreszcens-antigén-próbával mértük a macska-leukémia-vírus szaporodását. Megfigyeltük, hogy 100 mikromólos és ennél magasabb koncentrációk esetében a leukémia-vírus eltűnik, ami azt mutatja, hogy ebben a koncentrációban a hatóanyag teljes mértékben hatásos; 50 mikromólos koncentrációban a gátlás 60 %-os, 10 mikromólos koncentrációban a gátlás 45 %-os és 0,1 mikromólos koncentrációban 31 %. b) Az AID vírusra kifejtett hatás vizsgálata A 2,6-diamino-purin-9-(í3-D-2’,3’-didezoxi-ribofuranozid) AID-vírusfertőzésre gyakorolt gátló hatását a következőképpen határoztuk meg. Klónozott T4-pozitív tetanusz-specifikus T-limfocitákat AID-vírus-izolátummal fertőztünk (a dózist egészen 5000 virion/sejt/-ig emeltük), és megfigyeltük a sejt túlélését a fertőzés után. 10 napos tenyésztés után a fertőzött T sejtekben nem láttunk citopátiás károsodást, ha a a sejteket 10 vagy 2 mikromól koncentrációjú 2,6-diamino-purin-9-(0-D-2’,3’-didezo.xi-iibofurnnozld)-dal kezeltük; ha nem végeztünk kezelést, akkor a fertőzött sejtek száma nyolcszorosra nőtt. E védőhatást a kísérletnek mind a tizedik, mind a tizenharmadik napján megfigyeltük. c) A Fricnd-lcukémia-vírusra kifejtett hatás vizsgálata A vegyületek retrovírusokra kifejtett hatását a Friend-leukémia-víruson vizsgáltuk, és a következő eredményeket kaptuk. A vegyület ED50 (mikromól) 2,6-Diamino-purin-9-((3-D-2’,3’-didezoxi-ribofuranozid) 22,35 2’,3’-didezoxi-citidin 15,32 2’,3’-didezoxi-adenozin 19,25 2’,3’-didezoxi-guanozin 25,89 13. példa A sejttoxieitás (citotoxicitásj vizsgálata Vizsgáltuk az alábbi vegyületek sejttoxikus (citotoxikus) hatását 10'4 mól koncentrációban emberi D—98 és egér L-sejtekkel szemben. Az alábbiakban megadjuk a sejtek szaporodásának százalékos értékét a kontrolihoz viszonyítva. A vegyidet A szaporodás %-os értéke D-98 L 2,6-Diamino-9-(2’,3’didezoxi-j3-D-ribofura-zonil)-9H-purin 97 41 2-Amino-9-(2’,3’-didezoxiß-D-ribofuranozil)-9H-purin 97 107 9-(2 ’ ,3 ’-didezoxi-ß-D- rihofuranozil)-6- (mctil-tio)-9ll-purin) 98 91 9-(2',3'-Didezoxi-ß-ribofuranozil)-6-metoxi-9H-purin 92 90 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
