196511. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigénspecifikus sejtek elválasztására és kimutatására
2 196511 3 A találmány tárgya antigénspecifikus sejtadherencián alapuló eejtszeparéciós és diagnosztikai eljárás. Több mint 10 éve ismeretes Engwall és Perlman [J. Immunology, 109, 129-135 (1972)] munkája nyomán, hogy antigén molekulák köthetők műanyag felületekhez, és ezen a felületen az antigén-antitest reakció lejátszódik. Ismeretes, hogy sejtfelszíni antigének elleni ellenanyagok alkalmazásával az illető antigén markért hordozó sejtek műanyag felületre előzőleg felvitt, a markerrel szembeni antitestekhez kiköthetóek. [Mage, M. G., McHugh, LL. és Rothstein, T. L. (1977), J. Immunoi. Meth., 15, 47]. Az eddigi eljárások során, ahol monoklonális ellenanyagok készítése volt a cél, immunizált állatokból a .hasznos’ ellenanyag termelő sejteket nem szeparálták, hanem az összes lép- vagy nyirokcsomósejttel együtt .vakon" fuzionálták a tumorsejtekkel. Ezáltal a fúziós és szeparációs technika igen körülményessé vált. Nem volt ismeretes olyan megfelelő technika, mellyel a specifikus ellenanyagot termelő sejtek megfelelően, in vivo dúsíthatok illetve elválaszthatók lettek volna. A találmány szerinti eljárás a fenti eljárások hátrányait kiküszöböli, lehetővé tesz célzott sejtfúziót a specifikus ellenanyagot termelő és a felhasználandó tumorsejtek között. A találmány lényege az antigén-antitest immunreakcióján alapuló sejtszeparálás. Az irodalomban a specifikus antitestet termelő sejtek in vivő körülmények közötti kimutatására illetve elválasztáséra alkalmas hasonló jellegű eljárás még nem került ismertetésre. Az általunk kidolgozott antigén-specifikus sejtadherencián alapuló technika (ASCAA) alkalmas ellenanyag-termelő sejtek kimutatására a sejteknek specifikus antigénjükhöz történő adherenciája alapján. A módszer lehetővé teszi ellenanyag-termelő sejtek kimutatását, így alkalmazható mint celluláris immunreaktivitást mérő módszer, felhasználható továbbá sejtszeperációs módszerként, mely alkalmas a rendelkezésre álló sejtszuszpenzióból specifikus ellenanyag-termelő sejtek izolálására. A módszer egyaránt alkalmazható immunológiai, diagnosztikai és biotechnológiai sejtszeparációs eljárásként. A módszerrel megoldható autoimmun betegségekben szenvedő betegek testnedveiból a specifikus ellenanyag-termelő sejtek kimutatása és azonosítása. Mint már említettük, monoklonális antitestek készítésénél módszerünk segítségével az immunizált állat lépéböl vagy nyirokcsomóiból a specifikus ellenanyag-termelő sejtek izolálhatók, és a szeparált sejtek ezután szelektíven fuzionálhatok tetszőleges tumorsejt- vonallal. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a szeparálandó, specifikus ellenanyagot termelő sejteket tartalmazó elegyet műanyag lemezre felvitt megfelelő antigénnel hozzuk érintkezésbe. Az általunk kidolgozott ASCAA-módszer teljes folyamatát az 1. számú ábrán tüntetjük fel. Első lépésként műanyag lemez felületére antigén molekulákat viszünk fel. Ezt a lépést érzékenyítésnek nevezzük. A műanyag lemez minősége nem kritikus, célszerűen mikrotitráló lemezt alkalmazhatunk. Előnyös a PVC vagy polísztirol alapanyagú lemez alkalmazása. Vizsgálataink során elsősorban Periplate (propilén Gmk, Pécs) vagy Dynatech M 129A mikrotitráló lemezeket használtunk. A lemezek érzékenyitését célszerűen PBS-coating pufferban végeztük, melynek összetétele a következő: NaHzPCM x HzO 0,345 g/l=2,5 mmól NadlPOí x 12 H2O 2,68 g/l=7,5 mmól NaCl 8,474 g/l=145 mmól. Az érzékenyités során célszerű, hogy a fehérje-antigén töltése minél nagyobb legyen. Ezért azt célszerűen 7 és 9 közötti pH-értéken végezzük. Az antigén-oldat célszerűen desztillált vízzel készíthető és pH-ja 7,2 ± 0,2. Alkalmazható azonban természtesen más összetételű és pH-értékű oldat is. Az antigént célszerűen a coating pufferban oldjuk fel úgy, hogy az érzékenyítéshez megkívánt mennyiséget 100 wl coating pufferban oldva visszük fel a lemezre, illetve a mikrotitráló lemez mélyületeire. Az igy felvitt oldattal a lemezeket rövid ideig állni hagyjuk; így például 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Második lépésként célszerűen a nem kötődött antigént lemossuk a műanyag lemez, illetve a mélyületek felületéről. A mosáshoz használt egy lehetséges mosópuffer összetétele a következő: 1 liter PBS-coating puffer 0,5 ml Tween 20 detergens 20,2 g NaCl. A találmányunk célszerű megvalósítása esetén 3x3 percig tartó mosást végzünk, és mikrotitráló lemezek alkalmazása esetén a lemez minden egyes mélyületébe 250 pl mosópuff ért viszünk fel. A harmadik lépés a műanyag felület szabad kötőhelyeinek telítése a sejtekre nem káros, az antigénnel immunológiai rokonságban nem álló fehérje (például marha szérum albumin, BSA) oldatával. Egy ilyen alkalmazható BSA telítő oldat 0,5% BSA-t (Fraction 5, Sigma) tartalmaz, a PBS-Tween 20 mosóoldatban oldva. A lemezeket célszerűen 30 percig 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, mikrotitráló alkalmazása esetén a mélyületekbe 100-100 ul telitőoldatot adagolunk. Ezen lépés célja, hogy megakadályozzuk a sejtszuszpenzióból különböző, nem-antigénspecifikus sejteknek a műanyag lemezhez való közvetlen kötődését. Ezt a lépést azonban 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
