196464. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására
2 196464 3 A találmány tárgya mikrobiológiai eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására a megfelelő 1,2-telitett származékaikból. A kortikoszteroidokat először az ötvenes években használták gyógyászati célokra, amikoris a kortizon-acetátot reumás arthritis kezelésére alkalmazták. A késóbi vizsgálatok bebizonyították, hogy az 1,2-helyzetben telítetlen hidrokortizon, illetve kortizon származékok, a prednizolon és prednizon, jelentős többlethatással rendelkeznek, és kevesebb só visszatartást okoznak. Ezt követően a legtöbb szteroidot, amelyet a kortikoidok okozta betegségek kezelésére alkalmaztak, úgy állították elő, hogy az 1- és 2-helyzetben kettős kötést tartalmazzanak. 1977-ben két amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás a kortikoszteroidok szintézisére szterol prekurzorokból kiinduló eljárást javasolt, amely a kortikoszteroidok szintézisének új megkőzelitését jelentette. A 4 035 236 számú USA-beli szabadalmi leirés 9alfa-hidroxi-androszténdion előállítására vonatkozik szitoszterin, sztigmaszterin vagy koleszterin fermentálásával. A 4 041 055 számú USA-beli szabadalmi leirés gyógyászatiig alkalmas kortikoszteroidok ebből az androsztén-származékból való általános szintézisére vonatkozik. Az ebben a folyamatban leírt intermedierek 3-keto-A4'9ín> konfigurációjúak lehetnek. További, az 1,2-telitett szteroidok 1,2- -dehidro-szteroidokké való átalakításával foglalkozó irodalmi hivatkozások az alábbiak: A 2 837 464 számú USA-beli szabadalmi leirés Corynebacteriummal történő dién-elöállitást ir le. A leírás szerint a szteroidok 1- -dehidrogénezését fermentációs úton, Arthrobacter (Corynebacterium) simplex segítségével hajtják végre. A 3 360 439 számú USA-beli szabadalmi leírás 1-dehidro-szteroidok előállítására vonatkozik. A szteroidok 1-dehidrogénezését úgy végzik el, hogy A. simplex sejteket rövidszénláncú alkanollal vagy alkanonnal, például acetonnal előkezelnek, majd szubsztrátumraal és egy hidrogén átvivő katalizátorral összekeverik. Charney, W. és Herzog, H.: Microbial Transformation of Steroids (Academic Press, Inc., New York, 4-9. és 236-261. oldalak /1967/) című könyvében a szteroid biokonverziókról ad történeti áttekintést, és felsorolja az 1-dehidrogénezéshez ismert és használatos mikroorganizmusokat. Yamane, T., Nakatani, H. és munkatársai (Biotechnology and Bioengineering, 21, 2133 /1979/) 4-androsztén-3,17-dion Nocardia rhodocrous mikroorganizmussal történő 1-dehidrogénezésének vizsgálatát végezték el 50% benzol-heptán tartalmú elegyben. Ennek az oldószernek a biokonverziós elegyhez való hozzáadása következtében a reakciósebesség 180-szeresére növekedett. A benzol azonban rákkeltő tulajdonságú. A Nocardia rhodocrous aktivitása szempontjából az előnyös eketron akceptor a fenazin-metoszulfét volt. Ez az elektron akceptor túl drága és instabil ahhoz, hogy a biokonverziós folyamatokban használni lehessen. A Nocardia rhodocrous enzim inaktiv volt menadion, (2-metil-l,4- -naftokinon), az Arthrobacter simplex baktérium szempontjából kedvező elektron akceptor jelenlétében. A Nocardia rhodocrousban lévő enzim különbözik az A. simplex által termelt enzimtől. A reakció 20% szteroid tartalmú szerves oldószerben játszódott le. Kimutatták, hogy $ szteroid növekvő koncentrációjával a reakciósebesség csökkent. Az oxigén az 1-dehidrogénezési reakció nélkülözhetetlen eleme.-Az alkalmazott oldószer (50% benzol-heptán) oxigén jelenlétében gyúlékony. Azt, hogy az oxigént hogy vezették be a rendszerbe úgy, hogy a gyulladást elkerüljék, nem ismertették. Somoto, K., Jin, I. és munkatársai (Agricultural Biological Chemistry, 44, 1119-1126 /1980/) a hidrokortizon A. simplex-szel való 1-dehidrogénezését vizsgálták. Két egymással nem elegyedő oldószert, n-butanolt és n-amil-alkoholt használtak, de a biokonverzió nem játszódott le ezeknek az oldószereknek a jelenlétében. Vízoldható oldószereket, például 10% metanol-viz és 10% propilén-glikol-viz, találtak oldószerként a legmegfelelőbbnek. Összefoglalóan megállapítható, hogy az ismert irodalmi hivatkozások nem ismertetnek vagy javasolnak találmányunk szerinti javított eljárásokat. Találmányunk szerint hővel szárított, a szteroidok 1-dehidrogénezését katalizálni képes mikroorganizmus sejteket alkalmazva az 1,2-telitett szteroidok a megfelelő 1,2- -dehidro-származékká lényegesen jobb konverzióval alakíthatók át, mint az eddigi legjobb irodalmi hivatkozásban ismertetett vizes közegben, exogén elektron akceptor jelenlétében történő reakcióval, aholis a kitermelés a legjobb, a reakciósebesség a leggyorsabb volt. A találmányunk szerinti eljárás előnyei az ismert mikrobiológiai szteroid-dehidrogénezési eljárásokkal szemben: a) a biokonverzió végtermékében kevesebb az étalakulatian szteroid, b) a reakció nagyobb szteroid koncentráció alkalmazáséval hajtható végre, c) fajlagosan kevesebb mikroorganizmus sejt, például A. simplex szükséges a szteroid konverziójához, d) az eljárás a szteroidban, a mikroorganizmus sejtjeiben vagy a sejtek által a szteroid ból végzett szennyeződésekkel szemben kevésbé érzékeny, e) a redukció vagy a mikroorganizmus sejtekben jelenlévő szteroid degradáló enzimek teljes eltávolítása nagyobb kitermeléssel valósítható meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
