196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására
6 196462 7 A H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH polipeptidet thyro-globulinnal la továbbiakban TG) kapcsoljuk Goodfrien és társai módszerével (Science 144, 1334 /1964/k Magát a peptidet szokásos peptid-szintetikus módszerekkel állíthatjuk elő. A szilárdfázisú és folyadékfázisú módszert egyaránt felhasználhatjuk, bár sok esetben a folyékony fázisú szintetikus módszer előnyös. Megfelelő peptid-szintéziseket pl. az alábbi irodalmi helyek Írtak le: Schröder és Lübke: .The Paptides", Vol. 1. Academic Press, New York, USA, 1966; vagy Izumiya és társai: .Peptide Syntheses', Maruzen, Tokyo, Japan, 1975; vagy Haruaki Yajima: .Experiments in Biochemistry", Vol. 1. 207-400 oldalak, Tokyo Kagaku Dojin, 1977. E módszerek közül - többek között - az azidos, kloridos, savanhidrides, vegyes savanhidrides, DCC és aktív észteres módszereket, a Woodwark K.-reagenst felhasználó módszert, a karbodiimidazolos módszert, az oxidációs-redukciós módszert és a DDCC/addíciós (pl. HONB, HOBt, HOSu) módszert említjük meg. Az IFN~í 131-146, fragmensének részletes előállítása a 103 898 sz. európai szabadalmi leírásban került ismertetésre. 2,5 rag fenti polipeptidet 3,75 mg TG-vel összekeverünk, majd 2 ml 50 millimólos foszfát-puffért adunk hozzá és az elegyet jegesvízben erőteljesen keverjük. Ezután fokozatosan 30,4 mg karbodiimid-hidroklorid és 200 ml desztillált víz oldatát csepegtetjük hozzá. A reakció befejeződése után desztillált vízzel szemben 24 órán át dializáljuk, majd liofilizáljuk. 4,7 mg fehérje-komplexet kapunk. 2. példa Enzimhez kötött antigén előállítása az enzim immunológiai meghatározáshoz (EIA) az antitest kimutatáséhoz Az EIA számára az enzimhez kötött antigént Kitagawa és tsai módszerével állítjuk elő (Journal of Biochemistry 79, 233 /1976/). (i) A maleimido-csoport bevitele a polipeptidbe. Az 1. példa szerint előállított polipeptidet (350 nmól) 1 ml 100 mmólos foszfát-puff erben oldjuk (pH 6,8) és az oldatot 585 pg (1,75 nmól) N-(4-karboxi-ciklohexil-metiU-maleimid N-hidroxi-szukciimid-észternek 70 pl N,N-dimetil-formamiddal képezett oldatához adjuk. Az elegyet 30 °C-on 30 percen ót keverjük. A reakció befejeződése utón Sephadex G-25 oszlop felhasználásával kromatografálva 185 nmól, bevitt maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid frakciót kapunk. (ii) A maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid 6-D-galaktozidázzal történő kapcsolása. A maleimido-csoportot tartalmazó polipeptidet (16,5 nmól.) 3,3 nmól ß-D-galaktozidázzal elegyítjük. A reakciót 4 °C-on 18 órán át végezzük, majd 412,5 nmól ß-merkapto-etanol hozzáadásával leállítjuk. A ß-D-galaktozidázzal kapcsolt polipeptidet Sepharose 6B oszlopon frakciónáljuk és a további kísérletekben felhasználjuk. 3. példa Immunizálás 6 db 7-8 hetes BALB/C egeret 40 ug (fehérjében kifejezve) az 1. példa szerint előállított fehérje-komplex mint antigén Freund-féle teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékével szubkután inokulálunk (primer immunizálás). A primer immunizálás utón két héttel az egereket a fentivel azonos dózisú antigén Freund-féle nem-teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékével szubkután ismét inokuláljuk (szekunder immunizálás). További két hét elteltével a második immunizálással azonos módon harmadik immunizálást hajtunk végre. A harmadik immunizálás utón 6 nappal az egerekből részleges vérmintát veszünk és a szérum-antitest titereket az alábbiakban ismertetésre kerülő ElA-módszerrel meghatározzuk (lásd: Immunopharmacology 1, 3 /1978/). A legmagasabb antitest-titert mutató tj-2 számú egeret 120 ug antigén 0,5 ml vizes nátrium-kloriddal képezett oldatának intravénás inokulálásával végső immunizálásnak vetjük alá. Az egyes egerek antitest-titer adatait az 1. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5
