196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
10 196461 11 1. táblázat Immunizált egerek antipeptid-antitest titere B/T (%) Az egér száma Első immunizálás 1) Második immunizálás 2) Harmadik immunizálás 3) 7-1 4) N.D 24.5 2 N.D. 5) 19.3 35.3 3-N.D. 24.7 4 N.D. 1.3 1.7 5 N.D. 1.8 5.0 6-N.D. 0.8 normál egér 0.6 0.1 N.D. 1) Szérum higítás aránya: 1/1000 2) Szérum higítás aránya: 1/6300 3) Szérum hígítás aránya: 1:7800 4) -: nem kimutatható 5) N.D.: nem határoztuk meg B/T: (kötött enzim aktivitás/teljes hozzáadott enzim aktivitás) x 100 EIA-módszer A 2. példa szerint előállított fehérje-komplex-szel immunizált egerek szérumában vagy a hibridoma felülúszóban levő antitest-aktivitást EIA-módszerrel határozzuk meg. [Immunology 1, 3 (1978)]. A szérumot vagy a hibridoma felülúszót A-pufferrel (20 mM NazHPOí, 100 mM NaCl, 0,1% NaN3, 1 mM MgCk, pH 7,0) hígítjuk, majd a hígított elegy 100 jul-es részletét 100 pl enzimhez kötött polipeptid-származékkal (2. példa) elegyítjük és a reakciót 24 °C-on 24 órán át folytatjuk. Ezután 100 ul 3%-os, nyúl anti-egér IgG-vel kapcsolt cellulózt adunk hozzá és a reakciót 24 °C-on 4 órán át folytatjuk. A reakció befejeződése után a cellulózt 0,5% Tween 20-t tartalmazó A-pufferrel alaposan mossuk, 500 /ul 20 /ug/ml-es 4-metil-umbelliferil-ß-D-galaktozidot adunk hozzá. A reakciót 37 °C-on 2 órán át végezzük, majd 3 ml 100 mmólos karbonát-puffer (pH 10,5) hozzáadáséval leállítjuk. A fluoresszencia intenzitást fluorométerrel mérjük, (gerjesztés 365 nm; emisszió 450 nm). 4. példa Sejt-fúzió A 3. példában leírt végső immunizálás után három nappal a >-2 egér lépét kivágjuk, rozsdamentes szűrőn nyomás alatt átszűrjük és Eagle-féle minimális esszenciális közegben (MÉM) szuszpendáljuk. ily módon lép-sejt szuszpenziót nyerünk. A sejt-fúzióhoz BALB/C egérből származó P3-x63.Ag8.Ul (P3U1) mieloma-sejteket alkalmazunk. [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)]. A sejt-fúziót Kohler és Milstein eredeti módszerével végezzük el [Nature 256, 495-497 (1975)]. A lépsejteket és P3U1 sejteket külön-külön szérum-mentes MEM-el há- 20 romszor mossuk és 5 : 1 arányban (a sejtek .számában kifejezve) összekeverjük. Az elegyet 8000 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, ezalatt a sejtek kiülepednek. A felül elhelyezkedő folyadék ala- 25 pos eltávolítása után az üledéket enyhén fellazítjuk, 0,3 ml 45%-os polietilénglikol (PEG) 6000-t (Koch) adunk hozzá és az elegyet 37 °C-os meleg víztartályban 7 percen át állni hagyjuk, mikoris a sejt-fúzió lejátszódik. 30 Ezután 2 ral/perc sebességgel MEM-t adunk hozzá. Az összesen 12 ml MÉM hozzáadása után kapott elegyet 600 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, majd a felül elhelyezkedő folyadékot eltávolítjuk. 35 A sejt-üledéket 10% magzati borjú szérummal kiegészített RPMI-1640 táptalajban (RPMI 1640-10FCS) szuszpendáljuk 2xl05 P3U1 sejt/ml koncentrációban és 24-mélyedéses multi-csészékben (Linbro) levő 144 mélyedést 40 1~1 ml szuszpenzióval beoltunk. A beoltás után a sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid-gázt tartalmazó inkubátorban 37 “C-on inkubáljuk. 24 óra elteltével HAT-szelektiv tenyésztést indítunk meg oly módon, hogy HAT-tal 45 (lxlO4 M hipoxantin, 4xl0'7 M aminopterin, l,6xl0'5 M timidin) kiegészített RPMI 1640- -10FCS táptalajt adunk hozzá, 1 ml/mélyedés mennyiségben. A HAT-szelektiv tenyésztést folytatjuk, miközben a starttól számított 3., 50 5. és 7. napon 1 ml régi tenyészetet 1 ml HAT-közegre cserélünk le. A hjbridómák növekedését a sejt-fúzió után 10-14 nappal figyeljük meg. Mihelyt a fermentlé szine sárgába megy át (kb. lxlü6 sejt/ml) a felülúszót 55 összegyűjtjük és az antitest jelenlétét az EIA-módszerrel megvizsgáljuk. A fenti módon 141 olyan mélyedést vizsgálunk meg, amelyben hidribóma növekedést megfigyeltünk. Két mélyedésben 1x2-11 és >:2-10Ü) intenzív anti- 60 test-aktivitást, mig két másik mélyedésben l>2-62 és >2-70) gyenge antitest-aktivitást figyeltünk meg. 65 7
