196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
2 196461 3 A találmány Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Val Ala Asp Asn Gly Thr Lys Asn Trp Lys Glu Glu Gin Ser Gin Ile Val Ser Lys Asn Phe Lys Asp Asp Val Glu Thr Ile Lys Glu Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Gin Arg Lys Ala Ile His Alá Glu Leu Ser Pro Ala Lys Arg Ser Gin Met Leu Ser Gin aminosav-szekvenciét magábanfoglaló - amely szekvencia az amino-végcsoporton adott esetben további metionin-maradékot tartalmazhat -, proteolitikus fragmentjeitől mentes 20 humán immun interferon és a fenti humán immun interferont tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik. A találmány tárgya részletesebben: eljárás proteolitikus fragmentjeitől mentes intakt 25 humán immun interferon előállítására oly módon, hogy az intakt rekombináns humán immun interferont az azt tartalmazó transzformáit mikroorganizmusokból a proteáz-enzim-aktivitást gátló, ugyanakkor azonban az im- 30 mun interferon biológiai aktivitását nem befolyásoló anti-proteolitikus reagenssel (pl. guanidin-hidrokloriddal) extraháljuk és a kapott extrahált interferont új monoklónális anti-testek felhasználásával immun interfe- 35 ronná tisztítjuk. Az ábrák rövid ismertetése Az 1. ábrán tisztított rekombináns hu- 40 mán immmun interferon nétrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézisét (a továbbiakban SDS-PAGE) mutatjuk be redukáló (A; 0,7 mól ß-merkapto-etanol) és nem redukáló (B) körülmények között. 45 A 2. ábrán a rekombináns humán immun interferon várható aminosav-frekvenciáját a 15K és 18K rlFN-K species tényleges DNS szekvenciájával hasonlítjuk össze. A 3. ábrán a 15K és 18K rlFN-'x C-ter- 50 minális peptidjeinek HPLC elválasztásét mutatjuk be CNBr kezelés után. A 4. ábrán a 18K rlFN-'ü triptikus pepiid térképét mutatjuk be. Az irodalomban számos módszert ismer- 55 tettek az interferon néven ismert virus-ellenes fehérje-család extrakciójára és tisztítására. Jelen ismereteink szerint három főbb interferon-típust különböztetünk meg: IFN-oc (leukocita), 1FN-/Í (fibroblaszt) és IFN-'ji (im- 60 mun). Bár a különböző interferon-típusok vírus-ellenes és búrjánzásgétló hatásuk vagy szerkezeti felépítésük alapján összefüggnek, az irodalomban eddig egyetlen egységes módszert sem ismertettek mindhárom interfe- 35 Tyr Val Lys Glu Alá Glu Asn Ala Gly His Ser Asp Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Asp Arg Lys Ile Met Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Gin Ser Ile Gin Lys Ser Asp Met Asn Val Lys Phe Lys Arg Asp Asp Phe Glu Val Thr Asp Leu Asn Val Glu Leu Ile Gin Val Met Ala Lys Thr Gly Lys Arg Phe Arg Gly Arg Arg Ala ron■típus extrakciójára és tisztítására. . A leukocita-interferonnak más fehérjéket és sejtmaradványokat tartalmazó nyers keverékbői történő extrakciójára és tisztításéra felhasználható módszerek v alójéban nem alkalmasak fibroblaszt vagy immun interferonnak ugyanezen készítményből történő extrakciójára és tisztítására. Az ismert tisztítási eljárások extrakciós lépése sorén a mikroorganizmust mechanikus (azaz szonifikációs) vagy kémiai lizisnek vetették alá, amelynek sorén - gyakran rekombinéns módszerek útján - nyerték a kívánt .idegen" fehérjét. A mechanikai vagy kémiai lizis-módszerek során azonban a keverékbe különböző sejt-proteázok is bekerülnek. E proteázok ezután enzimes behatás révén lebonthatják a keverékben levő .idegen" fehérjét. E proteázok ezért megakadályozhatják vagy gátolhatják az .idegen" fehérje teljes vagy érett és biológiailag aktív formájának homogén szintig történő tisztítását. Találmányunk célkitűzése az ismert extrakciós és tisztítási módszerek hátrányainak kiküszöbölése és immun interferon intakt szekvenciájának előállítása, amelynek sorén a proteolitikus lebontásból származó fragmenseket a tisztított immun interferon készítményből eltávolítjuk. Találmányunk további célkitűzése az immun interferon homogén és intakt formájának előállítása. A találmány előnyös foganatositási módjainak ismertetése Azt találtuk, hogy immun interferon esetében a szokásos és az irodalomból ismert extrakciós és tisztítási módszerekkel nem nyerhető intakt vagy teljes aminosav-szekvenciával rendelkező, teljes homogén immun interferon. A rekombináns technológia csupán a közelmúltban ért el olyan fejlettségi fokot, amelynek segítségével a jellemzéshez és aminosav-szekvencia meghatározáshoz elegendő mennyiségű rlNF-'ü állítható elő. Az iTNF-y készítmények szokásos módszerekkel történő extrakciója és tisztított anyag aminosav-szekvenciájának meghatározása során azt 3
