196458. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteinkifejeződés fokozására a trp-operon Shine-Dalgarno-szekvencia és startkodon közötti DNS-szekvenciájának megváltoztatásával
2 196458 3 A találmány tárgya eljárás proteinkifejezódés fokozására a trp-operonnak a Shine-Dalgarno-szekvencia és a startkodon közötti DNS-szekvenciája megváltoztatásával. A trp-operon regulációs szekvenciáját eukariotikus proteinek kifejeződésére E. coliban sokféleképpen alkalmazzák. Egy DNS részlet, amely a trp-operon promoterjét és operátorát tartalmazza, a kereskedelemben már kapható. A trp-operon regulációs szekvenciájának módosítása ismert módszer, igy például a 3 247 922. sz. NSZK-beli közrebocsátási irat azt a módszert ismerteti, amellyel Serratia marcescens trp-operonjának regulációs nukleotidszekvenciájába a riboszóma kötőhely és a startkodon közé Hind III vágóhely építhető be. J. C. Edman és munkatársai a Nature 291, (1981) 503-506. oldalén ismertetik az E. coli megfelelő helyére Cla I vágóhely beiktatását. E módszerek hátránya az, hogy a riboszóma kötőhely és a startkodon közötti nukleotidok száma megváltozik a természetes számhoz képest. Felismertük, hogy egyetlen nukleotid kicserélésével, tehát a nukleotidszám megváltoztatása nélkül beépíthető egy restrikciós enzim vágóhely a riboszóma kötőhely és a startkodon közötti DNS-szekvenciába. A találmány értelmében ez úgy érhető el, hogy közvetlenül a startkodon előtt levő nukleozidot, az adenozint citidinnel cseréljük ki. A találmány tárgya tehát eljárás az E. coli trp-operonja DNS-szekvenciájának megváltoztatására, amely a .Shine-Dalgarno -szekvencia és az első startkodon között helyezkedik el, és amelyre a következő DNS-szekvencia jellemző: 5’GTATCGACC 3’ (I) 3’CATAGCTGG 5’ Ez az (I) szekvencia a felső szál 5’-végén a trp-operon .Shine-Dalgarno'-szekvenciájához 5’ AAGG 3’ 3’ TTCC 5’ (amely az RNS szintjén tulajdonképpen a riboszóma kötőhelynek felel meg) és a felső szél 3’-végén az ATG startkodonhoz kapcsolódik. A kövekezökben a találmány szerinti (I) szekvenciát összehasonlítjuk a természetes E. coli szekvenciájával és az Edman és munkatársai, id. helyről ismert szekvenciájával, az áttekinthetőség kedvéért azonban csak a felső szálat, a következőkben .kódoló szál'-at jelöljük: E. coli GTA TCG ACA Edman és mtsai GTA TCG AT (I) szekvencia GTA TCG ACC (Az E. coli szekvenciájához képest végzett változtatások alá vannak húzva). A találmány szerinti változtatás, azaz az A kicserélése C-re a következő előnyöket jelenti: Az ATG startkodon után kapcsolódva a guanozin következik, így az Nco I restrikciós enzim C CATGG felismeröhelyét képeztük. Ez a vágóhely lehetővé teszi, hogy DNS-t közvetlenül a startkodon szomszédságába építsük be, például a (II) általános képletü szintetikus oligonukleotid segítségével 5’ CATGX... 3’ (II) 3’ Y... 5’ a képletben X és Y egy strukturgén startkodonja utáni első komplementer nukleotidpárt jelenti. Ha X helyén G és Y helyén C áll, akkor a ligálási termékben az Nco I vágóhely megmarad. Ha viszont például egy szintetikus linkért építünk be, amelynek túlnyúló 5' CATG 3’ szekvenciája egy másik nukleotidhoz kapcsolódik, akkor az Nco I vágóhely megszűnik, de a startkodon utáni első aminosav szempontjából teljes variabilitás adódik. Természetesen megtehetjük azt is, hogy az Nco I-vel vágott DNS túlnyúló végeit enzinatikusan feltöltjük, például Klenow-polimerázzál, és az így kapott (III) szekvenciájú tompavégű DNS-t 5' GTA TCG ACC ATG 3’ (III) 3’ CAT AGC TGG TAC 5’ egy tompavégü (IV) szekvenciával 5’ X... 3’ (IV) 3’ Y... 5’ az (V) DNS szekvenciává ligáljuk 5’ GTA TCG ACC ATG X , ... 3’ (V) 3’ CAT AGC TGG TAC Y , ... 5’ ahol X és Y jelentése a fenti. íg.v egy bizonyos kifejezendő strukturgénhez további startkodonra nincs szükség. Ez például az N-terminálison megrövidített proteinek előállításánál előnyös. Lehetőség van a túlnyúló végek enzimatikus lebontására is, ilyenkor szintén egy tompavégü DNS szekvencia, a (VI) szekvencia képződik 5’ GTA TCG AC 3’ (VI) 3’ CAT AGC TG 5’ amely egy tompavégű (VII) szekvenciával 5’ Z ATG X ... 3’ 3’ Z’TAC Y ... 5’ a VIII) DNS szekvenciává ligálható 5’ GTA TCG ACZ ATG X ... 3’ (VIII) 3’ CAT AGC TGZ’TAC Y ... 5’ ahol Z és Z’ egy kívánság szerinti nukleotidpárt jelent, ami akár ki is hagyható. Ha Z és Z’ jelentése A, illetve T, akkor a természetes E. coli szekvencia képződik. Ezeken a sokoldalú klónozási lehetőségeken túl a találmány szerinti módszer azt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
