196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
12 196457 13 A terméket a reagálatlan izotópos anyagtól 10 ml-es Sephadex(K) G-50 töltetet tartalmazó oszlopon végzett gélszürésse) választottuk el. A töltetet 0,3 n nátrium-hidroxid-oldattal kezeltük 30 percig 70 °C-on az RNS elroncsolésa céljából, és sósavval semlegesítettük. A hibridizációkat a Kafatos és munkatársai által leirt módon végeztük (Nucleic Acids Res., 7, 1541-1552 /1979/) E. A pLl-pL30 klánok azonosítása Bimbóim és munkatársai (‘Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 /1979/) gyors plazroidelkülönitó eljárását alkalmaztuk ahhoz, hogy 1-1 ug plazmid DNS-at állítsunk elő 500, Escherichia coli K-12 294 törzsből transzformációval kapott termékből (lásd a C. pontot). Minden egyes DNS mintát denaturáltunk és három párhuzamos nitrocellulóz szűrőre vittük fel Kafatos és munkatásai eljárása szerint. A nitrocellulóz szűrők 3 sorozatán lévő 500 plazmid mintát az alábbi komponensekkel hibridizáltuk: a) az alaprész T-l sorozatával készített, indukált cDNS-val, b) az alaprész T-13 sorozatával készített, indukált cDNS-val és c) indukálatlan cDNS-val, amely mindkét alaprész sorozat felhasználásával készült. A kiónokat akkor tekintettük pozitívaknak, ha erősebben hibridizálódtak az egyik vagy mindkét indukált cDNS mintákkal, mint az indukálatlan mintával. Harminc .pozitív’ kiónt (pLl-pL30) választottunk ki az 500 közül további vizsgálatokhoz. F. A pL31-pL39 kiónok azonosítása, LelF géntöredéket tartalmazó plazmid (104. számú) elkülönítése Az Escherichia coli x 1776 törzsből transzformációval kapott termékeket Grunstein és Hogness tenyészethibridizációs módszerével (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 72, 3961- 3965 /1975/) vizsgáltuk, 32P izotóppal jelzett, indukált mRNS alkalmazásával (Lillenhang és munkatársai, Biochemistry, 15, 1858-1865 /1976/). Az indukálatlan sejtekből kinyert, izotóppal nem jelzett mRNS-at 200 : 1 arányban kevertük össze az izotóppal jelzett, indukált mRNS-val, hogy ellensúlyozzuk a 32P izotóppal jelzett anyagban jelenlevő indukálatlan mRNS-at. Az izotóppal jelzett mRNS hibridizációját előnyösen olyan tenyészetekkel végezzük, amelyek indukált szekvenciákat tartalmaznak. A transzformációval nyert termékek három fajtáját kaptuk: (1) A tenyészetek 2-3%-a igen erősen hibridizálódott a 32P-mRNS-val. (2) A tenyészetek 10%-a jelentősen kevésbé hibridizálódott, mint a fenti (1) csoport. (3) A többi tenyészetnél nem volt kimutatható hibridizáció, A pozitívnak talált tenyészeteknél (a fenti /I/ és /2/ csoport) megvizsgáltuk az interferonra specifikus szekvenciák jelenlétét olyan vizsgálattal, amely az interferon mRNS és a palzmid DNS közötti specifikus hibridizációtól függ. Kezdetben 60 erősen pozitiv tenyészetet (amelyek a fenti /1 / csoportba tartoznak) tenyésztettünk külön-külön 100 ml M9 táptalajon. Az M9 táptalaj 6 g/1 dinátrium-hid'rogén-foszfátot, 3 g/1 kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g/1 nátrium-kloridot és 1 g/1 ámmónium-kloridot tartalmaz, s adalékanyagként 20 ug/ml tetraciklint, 100 ug/ml diamino-pimelinsavat, 20 ug/ml timidint és 1 jug/ml d-biotint adtunk hozzá. A táptalajt autoklávban kezeltük, majd 1 ml steril 1M magnézium-szulfát-oldatot és 10 ml steril 0,01M kalcium-klorid-oldatot adtunk hozzá. 10-10 tenyészetet együttesen (pool) kezeltünk, és a plazmid DNS-t a Clewell és munkatársai által leirt módon (Biochemistry, 9, 4428-4440 /1970/1 különítettük el a kapott hat csoportból. Az egyes palzmid DNS csoportokból 10-10 pg mennyiséget Hind III enzimmel hasítottunk, denaturáltunk és kovalens kötéssel DBM (diazobenziloxi-metil) papírhoz kapcsoltunk. Minden egyes szűrőhöz 1 pg, indukált sejtekből származó tisztított mRNS-at hibridizáltunk. A hibridizálatlari mRNS-at mosással eltávolitottuk. A specifikus módon hibridizált mRNS-at eluáltuk és Xenopus laevis oocytákkal vizsgáltuk. Ily módon mind a hat csoport negatívnak bizonyult. 59 gyengén pozitiv tenyészetből (a fenti /2/ csoportból) 6 csoportot készítettünk. Közülük öt 10-10 tenyészetet, egy pedig 9 tenyészetet tartalmazott. Az egyes csoportokból elkülönítettük a plazmidokat és a fentebb ismertetett módon megvizsgáltuk. A hat vizsgált csoportból az egyik (K10) lényegesen magasabb szintes hibridizált az interferon mRNS-val, mint a háttér szintje, minden egyes mérés során. A specifikus interferon cDNS klón azonosítása céljából plazmid DNS- akat állítottunk elő a K10 csoport 9 tenyészetéből, és külön-külön vizsgáltuk a plazmid DNS-at. A 9 plazmid közül kettő (a 101. és 104. számú) lényegesen a háttérszínt felett kötődött az interferon mRNS-hoz. A 104. számú plazmidból egyetlen Bgl II restrikciós töredéket különítettünk el, amely 260 bázispárt tartalmazott. Ezt a töredéket 32P izotóppal jelöltük Taylor és munkatársai módszerével (Biochim. Biophys. Acta, 442, 324-330 /1976/1, és felhasználtuk 400, Escherichia coli K-12 294 törzzsel kapott, transzformált termék független vizsgáltához, in situ végzett tenyészetvizsgáló módszerrel (Grunstein és Hogness, Proc. Kati. Sei. USA, 72, ■ 3961-3965 /197 5/). Kilenc olyan tenyészetet lpL-31- -pL39) azonosítottunk, amely különböző rnér-5 .10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
