196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
8 196457 9 (hisztidin), I (izoleucin), K (lizin), L (leucin), M (metionin), N (aszparagin), P (prolin), Q (glutamin), R (arginin), S (szerin), T (treonin), V (valin), W (triptofán) és Y (tirozin). A számok az aminosavak helyzetére vonatkoznak (S a jel peptidre vonatkozik). .A 11’ a valamennyi LelF-ben (a pszendogén LelF E kivételével) közös aminosavakra vonatkozik. A 165 aminosavból álló LelF A szekvenciában a 44-es helyzetben található vízszintes vonal szerepe az, hogy összevethető legyen a LelF A szekvencia a többi LelF 166 aminosavból álló szekvenciáival. A LelF E szekvencia meghatározásánál figyelmen kívül hagytuk a kódoló tartományéban lévő külön nukleotidot (187-es helyzetben a 3. ábrán). A csillagok fázison belüli lezáró kodonokat jelölnek. Olyan aminosavak is láthatók, amelyek valamennyi LelF-ben megtalálhatók, a pszeudogén LelF E kivételével. Az aláhúzott maradékok olyan aminosavak, amelyek emberi fibroblaszt interferonban is jelen vannak. Az 5. ábra a nyolcféle LelF típussal (A-H) klónozott cDNS-ak restrikciós endonukleóz enzimekkel történő feltái'ással kapott összetételét szemlélteti. A hibrid plazmidokat a dC : dG alakitó módszerrel hoztuk létre (D. V. Goeddel és munkatársai, Nature, 287, 411- 416 /1980/h A cDNS beillesztéseket Pst I enzim alkalmazásával hasíthatjuk le. Az egyes cDNS beillesztések végén található vonalak a szegélyező homopolimer dC : dG végződést jelentik. Jeleztük a Pvu II, Ecolt I és Bgl II restrikciós helyek elhelyezkedését. Az ábra pontozott részei az érett leukocita interferonok kódoló szekvenciáinak felelnek meg, a vonalkázott részek pedig a jelölő peptid kódoló szekvenciáit jelképezik. Az üresen hagyott részek a 3’ és 5' nem-kódoló szekvenciákat mutatják. A 6. ábra az érett LelF A közvetlen mikrobiológiai szintézisét kódoló gén felépítését mutatja be vázlatosan. A restrikciós helyeket és maradékokat a Pst I stb. jelölés szemlélteti. A b.p. jelölés jelentése bázispár. A 7. ábra vázlatosan és nem méretarányosan mutatja be a LelF B érett leukocita interferon előállításánál alkalmazott két géntöredék restrikciós enzimekkel meghatározott összetételét. A feltüntetett kodon szekvenciák a kódoló ágak végződései, amelyek a Sau 3a restrikciós enzimmel végzett feltárással képződtek a két megadott esetben. A 8. és 9. ébrén öt találmány szerinti LelF fehérje, közöttük az I és J típus DNS és aminosav-szekvenciáit adjuk meg (a betűk jelentését illetően lásd a 4. ábrához adott magyarázatot). A 9. ábrán a csillag lezáró kodont jelöl a megfelelő DNS szekvenciában, a vonal pedig törlést vagy hiányt jelez a szekvenciában. A találmányt az alábbiakban részletesen ismertetjük: A. Az alkalmazott mikroorganizmusok Munkánk során elsősorban két mikroorganizmus törzset használtunk: Escherichia coli x 1776 (amelyet a 4 190 495 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek) és Escherichia coli K-12 294 (végződés A, thi", hsr", hsmk*) (amelyet a 2 055 382 A sz. nagy-britanniai publikált szabadalmi bejelentésben ismertetnek). Mindkét törzs az American Type Culture Collection mikroorganizmus-gyűjteményben lett deponálva ATCC 31537 illetve 31446 számon. Az összes DNS-rekombinációs kísérletet az amerikai egyesült államokbeli National Institutes of Health által megadott idevágó irányelvekkel összhangban végeztük. Jóllehet a találmány szerinti eljárás különösen előnyös változatánál az Escherichia coli x 1776 és Escherichia coli K-12 294 törzset használtuk, azonban más ismert Escherichia coli törzs is alkalmazható, például az Escherichia coli B vagy egyéb mikróbatörzsek, amelyek közül számos deponálva van és beszerezhető az elfogadott mikroorganizmus-gyüjteményektől, mint amilyen az American Type Culture Collection. Lásd ezzel kapcsolatban a 2 644 432 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocséjtási iratot. Az alkalmas egyéb mikroorganizmusok közül megemlíthetjük például a következőket: Bacilli, igy Bacillus subtilis, egyéb Enterobacteriaceae, így Salmonella typhimurium és Serratia marcescens. E mikroorganizmusok olyan plazmidokat használnak fel, amelyek reprodukcióra képesek és heterológ gén szekvenciákat tudnak termelni. Élesztők, például Saccharomyces cerevisiae is alkalmazható .gazda' organizmusként a találmány szerinti interferon fehérjék előállításához, mivel egy élesztő promotor irányítása mellett az ezt kódoló géneket termelnek. B. Leukocita interferon (LelF) üzenethordozó ribonukleinsav (mRNS) kinyerése és tisztítása A LelF mRNS emberi fehérvérsejtekből, általában krónikus csontvelő leukémiában szenvedő betegek fehérvérsejtjeiből nyerhető ki, miután a leukocitákat interferon termelésére serkentettük Sendai vagy Newcastle kór vírusával, a 2 947 134 sz. német szövetségi köztársaságbeli közre bocsátási iratban léírt módon. Különösen előnyösen a KG-1 megjelölésű sejtvonalból nyerhetjük a LelF mRNS-t, s munkánk során is így jártunk el. A KG-1 sejtvonal heveny csontvelő leukémiás betegtől származik, s Koeffler és Godle irta le (Science, 200, 1153 /1978/). A sejtvonal könnyen növekszik olyan táptalajon, amelynek összetétele a következő: RPMI 1640 (Rosewell Park Memorial Institute), 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
