196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
8 196456 9 vezet az elfajzott sejtek rosszindulatú tulajdonságainak megsemmisüléséhez és azáltal a permanens növekedési képesség megszűnéséhez, jóllehet ismeretes, hogy transzformált sejtek nem rosszindulatú sejtekből származó normális citoplazmával való fúziójával a rosszindulatúság kioltható. [Shay, W. J. és mtsai.: Supression of tumoringenicity in Cybrids. J. Supramol. St. Cell. Biochem. 16, 75-82 (1981)]. Ugyanúgy nem volt előrelátható, hogy vajon a sejtmagok az elfajzott sejtek izolált magjaival, például mielóma-magokkal közös genommá egyesülnek-e, ha a mieloma-citoplazmát nem visszük be a hibridbe. A fúzió ismert módszerekkel történik, célszerűen fuzionogén anyagok, előnyösen polietilénglikol vagy Sendai-vírus jelenlétében, mivel ezáltal hasonlóképpen, mint a hibridoma-technikánál a fúzió-kitermelés növekedése érhető el. A szakemberek további fúzionogén anyagokat is ismernek, és ezek szintén alkalmazhatók. A transzformált sejtek, tehát például a mielomasejtek fragmenseinek kinyerése ismert módszerekkel történhet. A sejtfalat előnyösen lizissel vagy mechanikusan feltörjük. Adott esetben utána a magfrakciók a citplazma-frakcióktól centrifugálással elválaszthatók, és a frakciók egyedül felhasználhatók. A lízist különösen előnyösen úgy végezzük, hogy a sejteket glicerinben hagyjuk duzzadni, és végül glicerinmentes pufferoldatba tesszük. Ez a setjmembránok felrepedéséhez vezet. Egy másik előnyös módszer karioplasztok és citoplasztok előállitása a sejt citochalasin B-vel, egy kereskedelemben kapható antibiotikummal való kezelésével. Ez az eljárás a Biochem. Biophys. Res. Comm. 63, 669-674 (1975)—bői ismert. Ennek az eljárásnak a során egyfajta .sejtoszlás' lép fel, amelyben egyrészt csak még a sejtmembránnal körülvett sejtmag, a karioplaszt és másrészt a szintén egy membrántól körülzárt, magnélküli citoplazma, az úgynevezett citoplaszt található. Mindkettő a találmány keretében a fúzió céljára egyformán alkalmasnak bizonyult, mint a lizissel vagy mechanikusan kapott sejtfragmensek illetve magok vagy citoplazmafrakciók, amelyek többé nincsenek sejtmembránnal körülvéve. A mechanikai feltárás a szakember előtt jól ismert módszerekkel történhet, amelyek itt magyarázatot nem kaphatnak. A sejtfragmenseket friss állapotban közvetlenül elóállitásuk után vagy csak később használják fel a fúzionáláshoz, mikoris utóbbi esetben liofilizált állapotban való tárolás szükséges. Transzformált sejtek alatt olyan sejteket értünk, amelyek ín vitro és in vivo a normális növekedési mechanizmusokat már nem tartják be. Példák erre rosszindulatú elfajzott sejtek, például ráksejtek, vírusfertőzéssel (például Eppsteiri-Barr vírussal) elfajzott sejtek és rákkeltő anyagokkal megváltoztatott sejtek. A nemzetközi gyakorlatban elterjedt .transzformált sejtek" kifejezés helyett a .permanensen növekvő sejtek' meghatározást is alkalmazzák. Amennyiben a találmány szerinti eljáráshoz setjfrakciókat használunk, úgy ezeknek nem kell teljesen tisztának lenniök, azonban intakt szaporodásképes sejteket nem szabad tartalmazniuk. A találmány egy lényeges ismertetőjele az, hogy a kapott hibridek nincsenek kitéve az elfajzott, nem hibrid, in vitro tenyészőképes sejtek versenyének, és ezért ezeknek növekedését HAT-szelekciós anyagokkal nem is kell visszaszorítani. Ezáltal a HAT-szelekciós táptalaj nagyon hátrányos befolyása a hibridekre elhárul, és a kitermelés és életképesség döntő javulását érjük el permenensen tenyészthető sejtekre. A találmány szerint továbbá a hibridképzés részére többé nem előfeltétel, hogy elfajzott sejtként HAT-szenzitiv sejtet alkalmazzunk. Van sok olyan permanensen tenyésző sejtvonal, amely semmilyen HAT-szenzibilitást nem mutat fel, és a hagyományos hibridoma-technikához nem volt alkalmazható, a találmány keretében azonban a fúzióhoz szükséges fragmensek előállításához használható. A sejteket citochalasin B-vel (gomba-metabolit) arra ösztönözzük, hogy magjukat egy szélsőséges kitüremkedésbe .extrudálják'. Nagy erők (például centrifugálás) hatására a vékony összeköttetés könnyen leszakad. Ezáltal egy magnélküli sejt-test (citoplaszt) és egy mag keletkezik, amely sejtmembránnal és egy keskeny citoplazma burokkal van körülvéve (karioplaszt vagy minisejt). Sem a karioplaszt sem a citoplaszt nem sokszorozódóképes, speciális funkcióikat azonban néhány órától néhány napig terjedő időig megtartják. A mag-extrudálás viszonylag magas citochalasin-B koncentrációt igényel, és amíg a kapcsolat meg nem szakad, teljesen reverzibilis. Kisebb citochalasin-B koncentrációk a sejtmegoszlást mitózis után mag-extrukció nélkül elfojtják. A standard módszert a citoplaszt/karioplaszt előállításra nem összetapadó sejtek esetére Wigler, M. H. és Weinstein, I. B. írják le. [Preparative Method for Obtaining Enucleated Mammalian Cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 63 669- -674 (1975)]. Kiderült továbbá, hogy nemcsak fentémlített B-limfociták, hanem minden más eddig vizsgált állati és emberi sejt is .immortalizálható" a találmány szerint (lásd 6-8. példa). Így különböző típusú sejtek, igy T-limfociták (a sejt által létrehozott immunitás hordozói és az immunrendszer szabályzó-sejtjei), endothel-se jtek (emberi köldökzsinórvénából származó falsejtek) és melanoma-sejtek (fagyasztással tartósított tumor-áttételes anyagból izolálva) permanens növekedésre késztet-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
