196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
2 196456 3 A találmány tárgya eljárás permanensen tenyészthető állati vagy humán sejtvonalak előállítására normál állati vagy humán sejtek transzformált sejtek komponenseivel végzett fúziójával, és az igy kapott sejtvonalak sejttermékek kinyerésére való alkalmazása. Régóta törekednek arra mind tudományos mind gyakorlati okokból, hogy emberi és állati sejteket normál állati és emberi szövettől függetlenül permanensen tenyésszenek. Mindeddig ez kielégítően nem sikerült, és csak kevés különleges esetben értek el permanens tényészthetöséget bizonyos vérsejteknél. Ismeretes, hogy definiált antigén-kötőspecifitású monoklonális antitestek előállítására az úgynevezett hibridoma-technikát alkalmazzák. Ezzel a Köhler és Milstein által kifejlesztett eljárással [Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256, 495-497 (1975)] egy egyetlen antitest (AT)-kötö sejt potenciálisan .halhatatlanná’ tehető, és kielégítően megsokszorozható. Az AT-kötő sejtnek (B-limfocita) egy rosszindulatúan elkorcsosodott sejttel (myeloma) való fúziójával olyan sejthibridekhez juthatunk, amelyek mindkét szülőrész tulajdonságait egyesítik magukban: azt a képességet, hogy antitesteket termeljenek, és a permanens növekedésre való képességet. Az új szó, a .hibridoma" a hibrid-sejt és a myeloma egyesítéséből keletkezett. Ezen technika különlegességeinek könynyebb megértetése céljából az antitestek (immunglobulinok, lg) szerkezetének és szintézisének néhány alapvető kérdését ismertetnünk kell. Egy Ig-molekula két azonos könynyű (L) és két azonos nehéz (H) láncból tevődik össze. Mindegyik H- és L-lánc genetikusán és funkcionálisan különböző szakaszokra oszlik fel. Az antitest antigén-kötőhelyei (angolul: combining sites) az úgynevezett változó tartományokban keletkeznek, amelyek magasfokú szekvencia-heterogenitással rendelkeznek. A sokrétű aminosav-cserék háromdimenziós szerkezetek nagy repertoárját hozzák létre, amelyek formájukban nagyszámú antigén komplementerei. Becslés szerint egy emlős 106 és 107 közötti különböző antigén-kötőhelyet tud kialakítani. Az antitest B-limfociták szintézis-terméke. Egy B-sejtnek egy törzssejtből való ontogenetikus kifejlődése alatt a sok rendelkezésre álló változó helyzetű gén egyike az aránylag kevés konstans helyzetű gének egyikével kombinálódik, éspedig mind az L- mind a H-lénc esetében. Amint a gén-asszociáció végbemegy, az illető B-sejt arra rendeltetett, hogy csak egyetlen típusú antitestmolekulát képezzen, és ezt a rendeltetést átörökíti leánysejtjeire is. Antigén-inger nélkül a B-sejt nyugalmi állapotban marad, anélkül, hogy szaporodna. Csak kevés immunglobulint termel és választ ki, sejtmembránjában szilárdan megkötve hordoz olyan antitesteket, amelyeknek pontosan azonos antigén-kötőhelyeik vannak, mint a kiválasztott antitesteknek. Ha egy antigén a szervezetbe behatol, a B-sejtek komplex celluláris interakcióinak egy sorozatét idézi elő. A B-sejtek, amelyeknek membrán-immunglobulinja az antigénnel specifikusan reagál, arra ösztönződnek, hogy osztódjanak, és egy leánysejt kiónt képezzenek, amelyek antitesttermelő sejtekre (plazmasejtek) differenciálódnak. Mivel egy B-sejtklón azonos szerkezetű és azonos antigén-kötőhelyekkel rendelkező antitesteket képez, egy ilyen klón terméket .monoklonális antitest'-nek nevezzük. Komplex felépítésű antigének, igy proteinek, mikroorganizmusok vagy sejtek sok különböző antigén hatású helyet (determinánsok, epitopok) tartalmaznak, és következésképp sok különböző B-sejtet stimulálnak, hogy osztódjanak, és kiónokat képezzenek. Ezért nagyszámú olyan antigén képződik, amelyek nagyságuk, töltésük, specifitásuk és affinitásuk tekintetében különböznek, és az immunszérumban együttesen jelennek meg. De az egyetlen determináns ellen irányuló immunválasz is mindig poliklonális. Ismeretes, hogy egerek egészen 103 különböző antitestig egyetlen egyszerű haptént, azaz egy izolált determinánst tudnak képezni. Ezek a tények megvilágítják, hogy rendkívül nehéz, ha nem lehetetlen, egy bizonyos antigén elleni antiszérumot reprodukálható módon előállítani. Sok év óta kutatnak ezért egy olyan eljárás után, amely lehetővé teszi, hogy elszigetelt B-se;teket klonálisan szaporítsanak, hogy ezen a módon homogén, monoklonális antitestekhez jussunk. A természetes példaképek a mielómák illetve plzamacitomák voltak, amelyek egerekben, patkányokban és emberekben rosszindulatú megbetegedésekként hoszszú ideje ismertek voltak. Mieloma akkor keletkezik, ha egy B-sejt rosszindulatúan elfajul, és akadálytalanul szaporodik, míkoris a leánysejtek kiónja nagymennyiségű homogén antitestet termel. Mielómák bizonyos beltenyésztett egértörzsekben kémiai manipulációval indukálhatok. Minden olyan kísérlet, hogy hiperimmunizálás és mielómaindukció kombinációjával ismert antigén-kötöfajlagosságú monoklonális antitestekhez jussanak, eredménytelen maradt. Ezek a fáradozások mindig olyan mielóma-sejtvonalakhoz vezettek, amelyek in vitro tenyészthetők voltak, és a hibridoma-technológia alapjául szolgáltak. Milstein és Köhler alapvető ötlete volt, hogy egy hibridsejtet hozzanak létre immunizált állatokból származó normál B-sejtek tenyészthető és permanensen növekvő mielómasejtekkel való fúziójával. Első kísérleteikben a mielómase jteket egy olyan egér lépőből származó limfocitákkal fuzionálták, amelyet juh-eritrocitákkal immunizáltak. így 10 életképes hibridet nyertek, amelyekből juh-eritrociták elleni fajlagossággal rendelkező két antitest képződött. Az an5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
