196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
12 196454 13 fragmentumon helyezkedik el egyrészt a 2 p eredeti replikációs helye [lásd: J. R. Broach (1981) idézett közleményét], amely a vektornak olyan tulajdonságot kölcsönöz, hogy az az élesztőben extrakromoszómálisan replikálódhassék és manifesztálódhassék, másrészt a 2 p DNS-ének REP3 lokusza is. Ez a lokusz a 2 p amplifikációs rendszerének egy fontos eleme és cisz helyzetűnek kell lennie, hogy a plazmidot képessé tegye a sokszorozódésra. A további fontos elemeket, mint a REP1 és REP2, a 2 p-DNS .vad’ másolatai szolgáltatják transz irányítottsággal lásd: M. Jayaram és munkatársai (1983) és Y. Kikuchi (1983) közleményeit. A III-as élesztő kromoszómából származó LEU2 szelekciós markert lásd: K. Struhl és munkatársai (1979) fent idézett közleményét néhány módosítás után az említett 2 ju DNS-fragmentum PstI hasítási helyére klónozzuk be. Ez a LEU2-d gén a leu2~ élesztő mutánsra való szelektálást teszi lehetővé és csak akkor viszi végbe a leu2~ mutációt, ha egy .sokraásolatú ’ vektorban fordul elő (lásd: J. Beggs (1978) idézett közleményét). Az YCRp3 és YCRp4 plazmid előállításához az YCRp2 DNS-éből 5 pg-ot BglII-vel és BamHI-vel emésztünk. Preparativ agaróz gél elektroforézis után egy 4,2 kb hosszú BglII/BamHI fragmentumot izolálunk. Ez a fragmentum tartalmazza az élesztő TRP1 gént és az ADH2-CEN3 fúziót. A pJDB207 plazmid-DNS 5 ju-ját teljesen megemésztjük BamHI-el, tisztítását fenolos extrahálással és etanolos kicsapással végezzük, majd borjúbél foszfatázzal - mint már leírtuk - defoszforiláljuk [lásd: G. Chaconas és J. H. van de Sande (1980) fent idézett közleményét]. Az így kapott pJDB207 plazmid DSN-ének 100 ng-ját ezután a 4,2 kb hosszú BglII/BamHI-YCRp2 fragmentummal kapcsoljuk össze ligázzal. Ennek a keveréknek az ötödrészével E. coli RR1 sejteket transzformálunk és az ApR telepeket izoláljuk. Minden telepet telep-hibridizációs eljárással vizsgálunk meg, amikor is az YCRp2 nick-transzlatált 4,2 kb fragmentumát használjuk próba-anyagként. A pozitívnak mutatkozó telepekből izoláljuk a plazmid-DNS-t és elkészítjük e plazmidok restrikciós térképét. Minthogy a BglII/BamHI fragmentum két különböző irányítottsággal épül be a pJDB207 BamHI hasítási helyére, kétféle plazmid keletkezik: az YCRp3 és YCRp4 (2. ábra). Az YCRp3 plazmid másolatszáma és stabilitása Megállapítottuk, hogy a beépített ADH2- -CEN3 fúzió iránya nincs befolyással az élesztőben lévő YCRp plazmidok stabilitására vagy másolatszámára. Az eredményeket az YCRp3 plazmiddal kaptuk, de az YCRp4 plazmid hasonlóan viselkedik. Meg kell jegyezzük, hogy az YCRp3 plazmid immár két élesztő gén-markert tartalmaz: a LEU2-d-t és a TRpl-et. A TRP1 gén csak akkor tesz teljessé egy trpl' mutációt magában az élesztőben, ha sejtenként csak egy másolatban van jelen, a LEU2-d gén csak akkor visz véghez egy leu2" mutációt, ha a gént egy .sokmásolatú ’ plazmid (sejtenként 50-100 másolatszám) tartalmazza. Ez a rendszer lehetővé teszi a másolatszam vizsgálatát egyszerűen csupán szelektív táptalaj tartalmú lemez-módszer alkalmazásával. Minden LEU* sejtnek legalább 50 plazmid másolatot kell tartalmaznia sejtenként, inig a TRP’ sejtek legalább 1 másolatot tartalmaznak sejtenként. Ezenkívül megemlítjük, hogy a SHU 32 törzs cir*, azaz .vad’ típusú 2 p DSN-t tartalmaz, ami az YCRp3 vektort a 2 p plazmid amplifikációs rendszerének még két további komponensével látja el: a REP1- -el és REP2-vel. A 2 p teljesen aktív sokszorozódási rendszeréhez 4 lokusz szükséges: REP1 és REP2 transz irányban, valamint a REP3 és ŐRI cisz irányban. A SHU 32 élesztő törzset (cir*, trp-, leu2", ura3~) az YCRp3 plazmid-DNS-el transzformáljuk, a TRP* transzformált sejteket izoláljuk, s a sejteket leu~ és ura* típusra levizsgáljuk. Minden vizsgált transzformáit sejt leu" és ura" volt és az YCRp3 plazmidot csak csekély másolatszámmal tartalmazták. Ez az eredmény nem volt meglepő, minthogy szénforrásként csak glükózt használtunk; a CEN3-nak tehát teljesen funkcióképesnek kellett lennie. Figyelemre méltó, hogy a CEN3 funkció a 2 p amplifikáló rendszerét elfedi és a plazmid másolatszámát sejtenként 1-2-re stabilizálja (a 2. táblázatban a 2-es példa; a 3. ábrán a 8. oszlop). A SHU 32 élesztő törzsben az YCRp3 stabilitása glükózzal való tenyésztés esetén ugyanúgy jellemzője egy YCp plazmidnak is (körülbelül 80%-a). Azonban, ha az YCRp3-al transzformált SHU 32 törzset szelektív -leu-etanol táptalajon tenyésztjük, csökken a plazmid stabilitása - ahogy azt a leu* telepek számából lemértük - körülbelül 65%-ra. Feltételezzük, hogy a CEN3 szekvencia etanol jelenlétében a reaktivált ADH2 promoter révén átiródik, s ennek eredményeképpen a CEN3 funkció blokkolódik. LEU* típusra és nem funkcionáló centromérára való szelektálással a 2 p sokszorozó rendszere veszi át a szabályozást és megtöbbszörözi az YCRp3 plazmidot magas másolatszámmal. Ha a SHU 32 transzformált sejtek LEU* típusúak, akkor ilyen körülmények között az YCRp3 plazmid stabilitása egy 2 p kiméra plazmidra jellemző (a 2. táblázat 2. és 4. példája). Ez az elvárás akkor igazolódott be, amikor a SHU 32 transzformált sejteket elanollal való tenyésztés után glükózzal tenyésztettük és meghatároztuk a plazmid másolatszámét. A 3. ábra 9-11. oszlopának adataiból világosan kitűnik, hogy az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
