196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
8 196154 9 hány kísérletben a teljes élesztő DNS-nek egy sor hígításét fejlesztettük ki a gélben, s így közvetlenül tehettünk összehasonlítást az YCRp sávok és a kontroll plazmid - ezekről tudtuk, hogy sejtenként csak 1-2 másolatban vannak jelen - sávok intenzitása között. Baktériumok közül transzformáláshoz mindenkor az E. coli RR1 törzset [F", pro", leu", thi", lacy, rpsh, hsdR, hsdM; lásd: S. L. Peacock és munkatársai fenti közleményét) használtuk. Az élesztők közül a Saccharomyces cerevisiai SHU 32 élesztő törzset [leu2, trpl, ura3; dr. A. Hartig (Universität Wien) bocsátotta rendelkezésünkre] használtuk transzformáláshoz. Emellett természetesen más élesztő törzsek is alkalmazhatók. A Miller által leirt [J. H. Miller, az .Experiments in Molecular Genetics' kiadvány 431-433. oldalén, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972)] LB táptalajt használtuk, de úgy, hogy miután a táptalajt autoklávozás után lehűtjük, 30 pl/ml ampicillint (Serva) adunk hozzá. Az élesztőket a következő táptalajokon tenyésztjük: YP táptalaj: 1% élesztő kivonat, 2% pepton és szénforrásként vagy 5% glükóz vagy 3% etanol. YNB+CAA táptalaj: 0,67% élesztő-nitrogén-bázisú aminosavak (Difco), 5% Difco Casamino acid (CAA) és szénforrésként vagy 5% glükóz vagy 3% etanol. TRP* szelekciónál az YNB+ + CAA táptalajt ,-trp drop-ouf oldattal egészítjük ki (minden 50 ml táptalajhoz 1 ml 50- szeres higitású oldatot adunk); LEÜ+ szelekciónál ,-leu drop-out) oldatot adagolunk azonos módon. Az élesztő táptalajt 2,5% Difco agar hozzáadásával szilárdítjuk meg. Az 1. ábra két plazmidot mutat be: pBC3Tl és ADH2BS. E plazmidok előállítási eljárása közleményekben megjelent [D. R. Beier és T. Young, Nature, 300, 724-728 (1982); V. M. Williamson és munkatársai, Cell, 23, 605--614 119811). A pBC3Tl plazmid a pBR322 plazmid egy részét tartalmazza az ampicillin rezisztencia génnel (ApK) és a ColEl replikációs kezdőpontjával (ŐRI! együtt, a szelektálhatóság és az E. co-liban való stabil növekedés érdekében. Ezenkívül tartalmazza a TRP1 gént egy EcoRI/EeoRI 1,45 kb hosszú fragmentumban, amely az élesztő III-as kromoszómájából származik |G. Tschumper és J. Carbon, Gene, 10, 157-166 (1980)1. Ez a gén a trpl" élesztő törzsek elválasztását feszi lehetővé, így azoknak az élesztő kiónoknak az izolálására használható, amelyek plazmidot tartalmaznak. Ugyanebben a DNS fragmentumban van az ARS1 (autonomously replicating sequence) fragmentum. Az ARS1 alkotórész feszi lehetővé, hogy a DNS az élesztőben anionom módon replikálód jók és így, mint plazmid viselkedjék (lásd Tschumper és Carbon fenti közleményét). A pBC.'iTI plazmidban vart még a CEN3 szekvencia, egy 2,0 kb hosszú HindllT-/BuniH 1 fregmentumon belül, amely az élesztő Ill-a kromoszómájából származik |A. C. Chi-nault és J. Carbon, Gene, 5, 111-126 (1979)). Azok a plazmidok, amelyek a CEN3 szekvenciát tartalmazzák, mitózis szempontjából stabilak és sejtenként 1-2 másolatszámmal vannak jelen. Az ADH2BS egy olyan pBR322 plazmid, amelynek BamHI hasítási helyére egy élesztő kromoszóma DNS-ből származó ADH2 gént tartalmazó 2,0 kb hosszú BamHI/Sau3A fragmentum van beépítve [V. M. Williamson és munkatársai, Cell, 23, 605-614 (1981)]. Itt a BamHI és a Sau3A ragadós végei közti kapcsolat a BamHI hasítási helyet regenerálja, így az ADH2 gén BamHI-el való hasítással az ADH2BS plazmidból kivágható. Az ADH2 génre leközölt DNS szekvenciából és az 5’ véget határoló szakaszokból tudjuk, hogy egy kedvező EcoRV hasítási hely van a +67-es pozícióban (ahol a +1 az ATG kodon A-ja). Ezt az EcoRV hasítási helyet a -1027 .upstream’ pozícióban lévő BamHI hasítási hellyel együtt arra használjuk, hogy az ADH2 promotert összes 5’ felé eső szabályozó szekvenciáival együtt izoláljuk. Az ADH2BS plazmid-DNS 5 pg-ját a szokásos módon EcoRV-el teljesen megemésztjük (1. ábra), ezután fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással tisztítjuk, a tompa végekhez 2 pg foszforilált BglII-linkert (5’-CAGATCTG-3’; Biolabs) kötünk és BamHI-el és BglII-vel újra hasítjuk; ezután preparatív agaróz gél-elektroforézissel egy 1300 bp hosszú fragmentumot izolálunk. Ez a fragmentum tartalmazza a teljes ADH2 promotert az összes szabályozó szekvenciával együtt és az ADH2-t kódoló szakasznak egy kis darabját (az első 22 aminosavat kódoló szakaszt). A pBC3Tl plazmid-DNS-ból 5 pg-ot teljesen megemésztünk BamHI endonukleázzal, fenolos extrahálással és etanolos kicsapással tisztítjuk, majd borjúbél foszfatázzal (CIP) defoszforiláljuk, ismert eljárás szerint [G. Chaconas és J. H. van de Sande, Methods Enzymol., 65, 75-79 (1980)]. A kapott anyagot újból extraháljuk fenollal, majd kicsapjuk etanollal, ezután a BamHI-el hasított és defoszforilált pBC3Tl plazmid DNS-ének 100 ng-ját összakapcsoljuk az ADH2 promoter 1,3 kb hosszú BamHI/BglII fragmentumának 200 ng-jéval, például T4-DNS ligáz segítségével. Ezután ennek a keveréknek az 1/5-éyel kompetens RR1 sejteket transzformálunk. Az ampicillin rezisztens telepeket telep-hibridizációval vizsgáljuk meg, amikor is az ADH2 promoter nick-transzléció segítségével jelzett, 1,3 kb hosszú BamHI/BglII fragmentumát használjuk próba gyanánt. Tizenkét pozitívnek mutatkozó telepből izoláltuk a plazmid DNS-t, amelyet különböző restrikciós endonukleázokknl emésztettünk, hogy azt a klont azonosítsuk, amelyben az ADH2 inszertum irányítottsága lehetővé teszi az ADH2 promoter transzkripcióját a CEN3 szekvencián keresztül. Ezt a kiónt izoláljuk és a 5 13 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
