196452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított alfa- és béta-interferonok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, genetikai információt tartalmazó mikroorganizmusok előállítására
8 196452 9 A Sendai vírussal 1 ml oocita IFN-oC IFN-c£ + IFN-Ű indukált Namalwa felülúszó ellen termelt antiszésejtekből származó interferon rumok által neutralizált ,12S"-poli(A)*RNS egység interferon aktivitás mennyisége tartalma százaléka 1 Mg 1000 80 >98 Tehát az interferon aktivitásának mintegy 80%-a neutralizálható az cí-tipusú interferon elleni antiszérummal, mig az összaktivitást csak az anti-cC- és anti-ß-interferon antiszérum keveréke neutralizálja. C példái Namalwa - cDNS - klónbank előállítása A 6 - 18S molekulatömeggel rendelkező poli(A)*RNS-t (.12S-RNS-; lásd a B példát) használjuk templátként az egyszálú cDNS előállításához úgy, hogy 40 (jg/ml poli(A)*RNS-t 50 mM trisz-sósavat (pH = 8,3), 10 mM magnézium-kloridot, 100 mM kálium-kloridot, 1-1 mM dNTP-t, 0,4 mM DTT-t, 4 mM nátriura-pirofoszfátot, 20 pg/ml oligo(dT)i2-is-at (PL-Biochemicals) és 25 jug/ml Actinomycin D-t 100 egység/ml AMV reverz transzkriptázzal (dr. J. Beard, Life Sciences, Inc. 1509 y 49th Street, South, St. Petersburg, Florida 33707, USA) 45 percig 44-45 °C-on inkubálunk. Ezt követően az RNS-DNS-hibrid RNS részét 0,3 M nátriuro-hidroxidban 50 °C-on történő egy órás inkubálással eltávolítjuk, ezután az egyszálú cDNS-t neutralizáljuk és etilalkohollal kicsapjuk. A szimpla DNS-szállal komplementer második DNS szálat a következő feltételek mellett szintetizáljuk: 30 jug/ml egyszálú cDNS-t 0,12 M kálium-foszfát puffer (pH = 6,9), 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT és 1- -1 mM dNTP elegyében 300 egység/ml DNS polimeráz I-el (Boehringer Mannheim) inkubálunk 6 órán át 15 °C-on, ezután az elegyet fenollal extraháljuk és etilalkohollal kicsapjuk. Az igy előállított duplaszálú cDNS-keveréket a szálvégeken úgy módosítjuk, hogy a túllógó egyszálú darabokat eltávolítjuk. Ennek elérésére a DNS-t 0,3 M nátrium-klorid, 30 mM nátrium-acetát (pH = 4,5) és 1 mM cink-klorid elegyében 1250 egység/ml SÍ nukleázzal (Miles Laboratories) 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, az elegyet ezután fenollal extraháljuk és etilalkohollal kicsapjuk. Az ily módon előállított .blunt ended" kétszálú cDNS-t 1 mM nátrium-acetát puffer és 1 mM EDTA tartalmú 5-20X szacharóz-grádiensben elválasztjuk és azokat a frakciókat izoláljuk, amelyek legalább 600 bázispár hosszúságúak. A kapott cDNS keverék 0,5 jug-jánál a kettősszálak 3’ végeit oligo-dezoxicitidin hozzáadáséval mintegy 15 nukleotiddal meghosszabbítjuk úgy, hogy az elegyet 140 mM kálium-kakodilát (pH = 6,9), 30 mM -trisz-sósav (pH = 6,9), 2 mM kobalt-klorid, 0,1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA és 5pM dCTP elegyében 500 egység/ml terminális transzferézzal inkubáljuk 4 percig 37 °C-on. Ezzel a lépéssel a rekombinéns molekulák egyik alkotórésze, a cDNS keverék, készen áll (lásd az 1. ábra baloldalát). Második komponensként az Escherichia coli pBR322 plazmidját - mely egy gyűrűs kétszálú DNS molekula - használjuk fel. A pBR3222 Mg-jának alikvot részét Pst I restrikciós endonukleázzal linearizáljuk, és hasonló módon, mint ahogy a cDNS-keveréknél jártunk el, a molekula 3’ végein oligo-dezoxiguanozin hozzáadásával olyan módosítást végzünk, hogy túllógó oligo-dezoxinukleotid végek keletkezzenek (az 1. ábra jobb oldala). Ezek az oligo-dezoxiguanozin végek bázispárosodás révén a cDNS molekulák szabad oligo-dezoxicitidin végeivel stabil kettősszálú DNS régiókat képeznek. E reakciónak mindkét komponensét 0,1 M nátrium-klorid, 1 mM EDTA és 20 mM trisz-sósav (pH = 8) elegyében 10 percig 65 °C-on, majd 2,5 órán át 45 °C-on, ezután egy éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. Ezzel a módszerrel a Pst I restrikciós endonukleáz hasítási helyét regeneráljuk és később az enzimet a cDNS inszertumnak a vektorhibridböl való kihasitására felhasználhatjuk. A pBR322-ből és a Namalwa-cDNS-böl ily módon előállított hibrid plazmidot használjuk fel, az irodalomból ismert módon [Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 69, 2110-2114 (1972)], az Escherichia coli HB 101 transzformációjára. Ezzel a módszerrel a transzformált Escherichia coli sejtekből 30000 kiónt kaptunk és ezeket egyenként mikrotitróló lemezekre osztottuk fel. D példa 60 IFN-c(-t és IFN-3-t meghatározó DNS szekvenciákra specifikus hibridizációs próba-anyag elóálitása egy szintetikus 5 'dCCTTCTGGAA CTG3' tridekanukleotid felhasználásé val 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6
