196425. lajstromszámú szabadalom • Eljárás primicin komponenseinek és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
3 196425 4 Találmányunk tárgyét a prinücin anyagkeverék komponenseinek előállítására szolgáló eljárás képezi. A találmányunk szerint a primicin anyagkeveréket vékonyrétegkromatográfiával és/vagy oszlopkromatográfiával komponenseire bontjuk és a komponenseket izoláljuk. A primicin eredeti magyar antibiotikum, mely 1954-ben vélt ismertté (Nature, 174, 1105, 1954). A Gram-pozitiv és Gram-negativ mikroorganizmusok ellem rendkívül alacsony koncentrációban hatékony: 0,04 ug/ml. A primicint a Thermopolyspore galeriensis sugár gombafaj törzsei termelik (153.593 sz. magyar szabadalmi leirés). Az irodalom egyetlen szerkezeti képlettel jellemzi a primicin!: (J. Chem. Soc., Perkin I. 1974, 816 p.) 18-arabinozil-2-n-butil-3,7,ll,15,19,21,23,25,27,37-dekahidroxi-4,16,32,34,36-pentametil-tetrakonta-16,32-dién-35-0-lakton-40-guanidinszulfát. Már a korábbi vizsgálataink is utalnak arra, hogy a fermentáció során keletkező primicin nem egységes anyag. A kromatogréfia fejlődése, amely az utóbbi időben jelentős változásokat hozott, lehetővé tette a primicin anyagkeverék behatóbb vizsgálatát. Célul tűztük ki a primicin anyagkeverék egyes komponenseinek szétválasztását és izolálását. Célunk megvalósításának érdekében többféle kromatográfiás módszert kipróbáltunk, és azt találtuk, hogy a legjobb szétválasztás a vékonyrétegkromatográfiás és az oszlopkromatográfiás módszerrel érhető el. A vékonyrétegkromatográfia (a továbbiakban VRK) területén addig nem tapasztalt nagy felbontású elválasztásokat eredményezett a gyárilag készített szilikagél készréteg lapok, majd a HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) lapok alkalmazása, alkalmasan megválasztott oldószerrendszerekben. Kísérleteink során először a Kieselgel 60 F254 jelzésű szilikagél készréteg lapot alkalmaztuk. Mérete: 20 x 20 cm, a szilikagél rétegvastagsága: 0,25 mm. E szilikagél készréteg lapon a primicin anyagkeverék megfelelő szétválasztása érdekében számos oldószerrendszert próbáltunk ki. A legjobb szétválasztást abban az esetben értük el, amikor a felhasznált eluens halogénezett szénhidrogén(ek), szerves sav(ak), alkohol(ok) és víz elegyéból tevődött össze, előnyösen aldehid(ek) hozzátétele mellett. Az eluensként alkalmazott oldószerek a következők lehetnek: halogénezett alifás szénhidrogének (pl. kloroform, diklór-metán), szerves savak: 1-4 szénatomszámú alifás karbonsav (pl. hangyasav, ecetsav), halogénezett alifás karbonsav (pl. monoklór-, diklór-, triklór-ecetsav, trifluorecetsav), aromás karbonsavak (pl. benzoesav), vagy szerves szulfonsav (pl. metánszulfonsav, p-toluol-szulfonsav), alkoholok: 1-10 szénatomszámú alifás- vagy elágazó-láncú (pl. metanol, etanol, n-butanol, izopropanol); aldehidek: 1-4 szénatomszámú alifás aldehidek (pl. 36%-os formaldehid). Legelőnyösebbnek bizonyult a kloroform: metanol : hangyasav : víz : formaldehid : n-butanol = 130 : 53 : 6 : 9 : 3 : 3 térfogatarányú elegye. Az előhívást Sakaguchi reagenssel és/vagy klórtilidines módszerrel és/vagy etanolos kónsavval és/vagy hőkezelés segítségével végezzük. Ezen oldószerrendszerben futtatva a primicin anyagkeverék néhány kisebb mennyiségű szennyezés mellett a következő Re értékekkel jellemezhető komponensekre válik szét: 0,29; 0,31; 0,33; 0,35; 0,37; 0,39; 0,54; 0,56; 0,58. Az elválasztás hatékonysága tovább javítható HPTLC lap használata esetén. Ekkor a fent leirt oldószer-rendszert kis mértékben Módosítani kell, hogy az Rf-értéket a kívánatos értékhatárok között tarthassuk. A módosított oldószerrendszer kloroform : metanol : hangyasav : viz : formaldehid : n-butanol = 160 : 53 : 6 : 9 : 3 : 3 térfogatarányú elegye. A primicin anyagkeverék és izolált komponenseinek kromatográfiás képét az 1. sz. ábrán mutatjuk be. A nehezen hozzáférhető és költséges KPTLC laphoz hasonlóan kitűnő elválasztást biztosít az általunk kidolgozott eljárás, melynek során alkalmas fémsóval, előnyösen ezüstsóval impi'egnált Kieselgel 60 F254 szilikagél lapon végezzük a kromatografálást. Az impregnálás során a VRK lapot vizes és/vagy szerves oldószeres, például acetonitriles fémsó oldatba mártjuk, előnyösen 20%-os vizes oldatot használunk. Az alkalmazott fémsók előnyösen ezüst-sók (pl. ezüstnitrát), vas-sók (pl. vas(II)foszfát) stb. lehetnek. Az impregnált rétegről a felületi nedvességet leszáritjuk, majd 120 °C-on, fénytől elzártan, egy órán át aktiváljuk. Az előzőekben ismertetett oldószerkeverékek ebben az esetben is jól használhatók a lap kifejlesztéséhez. Még jobb elválasztás érhető el abban az esetben, ha szerves savként monoklórecetsavat alkalmazunk. A futtatószer összetétele kloroform : metanol : viz : formaldehid : n-butanol = 125 : 53 : 9 : 3 : 3 térfogatarányú elegy, melyben 15 tömegrész monoklórecetsavat oldunk fel. Ebben a rendszerben nagymértékben javul az elválasztás hatékonysága azáltal, hogy az egyes komponensek Rf értékeinek különbsége megnő. A VRK-s szilikagél lemezen való futtatás előnyeit továbbfejlesztettük, amikoris kidolgoztuk a primicin anyagkeverék léptékű oszlcpkromatográfiás elválasztását. A2t találtuk, hogy megfelelő szilikagél töltetű, előnyösen kis túlnyomással működtetett oszlopkromatografía jól alkalmazható a primicin anyagkeverek egyes komponenseinek szétválasztására. K próbáltuk először az oszlop-töltetként szilikugélt tartalmazó saját töltésű oszlopot, majd a Merck gyártmányú Lobar-típusú készre töltött oszlopot, azután az általunk kidolgozott VRK-s módszerhez hasonló módon, vala5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
