196422. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antraciklin származékok és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
5 196122 6 T-citorocün 2 x 10*3 Ennek a tesztnek a lényege az alábbi. Exponentiális növekedési fázisban (5 x 103/ml RPMI-közeg) lévő L-1210 sejteket mikrotítráló lapon 72 órán keresztül a vizsgálni kívánt anyag különböző koncentrációval inkubálunk (37 °C, 5% COi. 95% relativ páratartalommal). A kontroll sorozat sejtjeit csupán friss közeggel inkubóljuk. Mindegyik kísérletet négy ismétléssel hajtjuk végre. 65 óra elteltével 14C-vel jelzett timidint adagolunk 50 m1( = 1.5 pC/ml) mennyiségben, ezzel a sejtek DNA-ját radioaktív jelzéssel jelöljük. 7 óra inkubáció után a sejteket leszívatjuk, a DNA-t 5%-os triklór-ecetsavval kicsapjuk és először vizzel, majd metanollal mossuk. Az 50°C-on végzett szárítás, valamint 5 ml szcintillációs folyadék hozzáadása után a DNA-ba beépített radioaktivitást megmérjük. Eredményként a kísérleti anyaggal inkubált minta szcintillációs mutatóját számítjuk ki a kezeletlen kontroll százalékában. Az így kapott értékek felhasználásával dózis-hatás-grafikont rajzolunk, amelyből az ICso-értéket grafikus ■ eszközökkel állapítjuk meg. {ICso = a kísérleti anyagnak az a koncentrációja, amely a teszt körülmények között a radioaktiv timidin beépítését 50%-kal csökkenti a kezeletlen kontrolihoz képest.) A találmány szerinti eljárást az alábbiakban közelebbről ismertetjük. 1. példa 4,5 g nyers citorodin-komplex (a 0131 181 sz alatt publikált európai szabadalmi leírás szerint előállítva) 250 ml 0,2 n sósav oldattal készített oldatát egy órán át 37 °C-on tartjuk, majd az oldat pH-értékét hűtött nátrium-hidi'oxid-oldattal 7,5-re állítjuk. Az oldatot 300-300 ml kloroformmal négyszer extraháljuk, és az egyesített kloroformos extrakturnokat vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot (2,1 g) kloroform, metanol, jégecet és víz 50 : 50 : 5 : 2 arányú elegyének (A/ rendszer) 30 ml-jében feloldjuk és olyan oszlopra visszük, amelyet 200 ml 40-63 mikron szeracseméretü, A) rendszerben feliszapolt Kieselgéllel (Merck 60) töltöttünk. Az eluáláshoz szintén a fenti oldószerelegyet használjuk. Az első 100 ml-t elfolyatjuk, utána 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, amelyeket vékonyréteg-kromatográfiával elemezünk (Ki— eselgel 60 F254 Merck, B) rendszer: kloroform/metanol/jégecet/-viz = 70 : 20 : 10 : 2). Az aktiv anyagok az alábbi frakciókban vannak: 18-31. frakció: S-T-citorodin 45-67. frakció: /j-rodoniicin II. A 18-31. frakciókat egyesítjük és addig hígítjuk 5%-os vizes dinótrium-hidrogén-foszfát-oldattal, mig a kloroformos fázis ki nem válik. A kloroíormos fázist egy térfogat dinátriura-hidrogén-foszfát-oldattaU egy térfogat vizzei mossuk, vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk, vákuumban betöményítjük és a terméket hexánnal kicsapjuk. Hozam: 540 mg kétkomponenses (S- és T-eitorodin) elegy. 2. példa Az 1. példa szerint kapott kétkomponenses elegy 300 mg-ját 20 ml Bl-rendszerben (lásd 1. példa) feloldjuk és olyan oszlopra visszük, amelyet 100 ml 15-40 mikron méretű, B)-rendszerben feliszapolt Kieselgéllel (Merck 60) töltöttünk. Az oszlopot a B)-rendszerrel eluáljuk. Az első 100 ml-t elfolyatjuk, utána 5 ml-es frakciókat gyűjtünk: 21-32. frakció S-citorodin 160 mg 41-80. frakció S-citorodin, kevés T-citorodin 35 mg 81-100. frakció T-citorodin 40 mg. A (termék szerint külön-külön) egyesített frakciókat 5%-os vizes dinátrium-hidrogén-foszfát-oldattal addig hígítjuk, mig a kloroformos fázis ki nem válik. A kloroformos fázist azonos térfogatú dinátrium-hidrogén-foszfát-oldattal, majd azonos térfogatú vizzel mossuk, vákuumban betöményítjük, és a terméket hexánnal kicsapjuk. Hozam: 160 mg tiszta S-citorodin 40 mg tiszta T-citorodin. 3. példa 1,1 g citorodin-komplex 60 ml 0,2 n hangyasavval készített oldatát 24 órán át 37 °C-on tartjuk. Az oldat a vékon.vréteg-kromatográfiai vizsgálat szerint S- és T- citoroding tartalmaz. Az oldat pH-értékét nátrium-hidroxid-oldattal 7,5-re állítjuk, majd az oldatot az 1. példában leírtak szerint feldogozzuk. 4. példa 0,5 g citorodin-komplex 28 ml vízzel készített oldatához keverés közben 0,64 ml trifluorecetsavat adunk, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten 4 órán ót állni hagyjuk. Utána az oldatból az 1. és 2. példa szerint kinyerjük az S- és T-citorodint. A komponenseket az alábbi mérési körülmények között azonosítottuk. A protonrezonancia-szénképet (lH-NMR-szinkép) HX 270 BRUKER Fourier-transzform típusú magrezonancia-spektrométerrel vettük fel 270 MHz frekvenciával. A koncentrációk 2- -4 mg/0,5 ml 99,8%-os CDCb voltak; az oldatokat mindjárt elkészítésük után 0,1 ml 5%-os NazCCto-oIdaLtal (99,5% D20). összerázzuk. Az ábrákon csillaggal jelölt jel%-os nagyságrendben jelenlévő kisrnolekulatömegü szennyeződésekből és oldószer-maradékokból ered. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
