196364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alifás tioéterek és azokat hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
55 196 364 56 a három állatnál nyert középértéket a három kontroll állatnál nyert középértékkel, és a következő képlet szerint kiszámítjuk a százalékos teljesítménygátlást: (1(H) - pii'pniitltimli‘l|cs!ini'6iy) • l(H> %-os gitllits = 100 - _____!__!______;_____” (100 — kontrolt teljesítmény) Ha különböző hatóanyag-koncentrációkat vizsgálunk, úgy minden egyes koncentrációra feljegyezzük a százalékos gátlást és az abszcisszára felvesszük a log. koncentrációt az ordinátákra felvett százalékos gátlással szemben. Az ICS0-t azután lineáris regressziós analízissel állapítjuk meg. In vitro teszt az A2 foszfolipáz-gátlás meghatározására emberi leukocitákból Neutrofil, polimorf tartalmú emberi leukocitákat - „Buffy coals”-ból kiindulva - többfokozatos frakciónak nedi mentádéval izolálunk és mélyhűtünk. Az A2 foszfolipázt a sejtszuszpenzióból homogenizálással extraháljuk, jéghideg 2 n NaCI-ben lévő 0,36 n H2S04- val és a 10 OOOxg-vcl történő centrifugálás után kapott felül úszót pH = 4,5-ös nátrium-acetát pufferrel szemben dializáíjuk. Az enzimaktivitás meghatározása céljából az enzimet (10—30 pg protein) 7-es pH-jú 0,1 m trisz/HCl-pufferben, 1 mmól CaCl2 és szubsztrátum hozzáadása mellett — a szubsztrátum bioszintetikusán 14C-olajsavval radioaktív jelzett Eserhia coli (2 /unól) foszfolipidekből áll — 37 °C-on 1 órán keresztül inkubáljuk. A reakciót megállítjuk Dola-reagens (izopropanol/heptán/1 n H2S04 40:10:1, v/v) hozzáadásával és az A2 foszfolipáz által szelektív szabaddá tett 14C-olajsavat extraháljuk. Hasonlóképpen az együtt extrahált szubsztrátumot az extraktumnak Kieselgéí-oszlopon történő szűrésével teljesen eltávolítjuk. A 14C-o!ajsav meghatározása az eluátumban radiokémiái úton történik. A vizsgálandó anyagoknak az A2 foszfolipázra gyakorolt gátló hatásának megállapítására, ezeket oldat alakjában — vízben, dimetil-szulfoxidban (végső koncentráció a keverékben 5 %-ig v/v) vagy etanolban (végső koncentráció a keverékben 2,5 %-ig, v/v) oldva adagoljuk az inkubációs rendszerhez. A vizsgálandó anyagnak hatásfokát az IC50 adat jellemzi, vagyis az a koncentráció, amely a kontrollaktivitásra 50 %-os gátló hatást gyakorol. Az lC50-t grafikusan határozzuk meg oly módon, hogy a százalékos gátló hatást az ordinátára visszük, az abszcisszára felvett log koncentrációval (jtzmól) szemben. A leírt kísérleti körülmények mellett a mepakrin az A2 foszfolipázt egy 1600 /xmólos lC50-értékke! gátolja. In vitro teszt a C foszfolipáz-gátlás meghatározására emberi trombocitákból Emberi trombocitákat „Buffy coats”-ból nyerünk frakcionált centrifugálással és végül mélyhűtéssel. A C foszfolipázt a sejtszuszpenzió ultrahangos kezelésével felszabadítjuk és az ultraccntrifugálás után (150 000 x g, 1 óra alatt) oldható alakban a felül úszóban található. Az enzimaktivitás meghatározása céljából az enzimet (20-100 pg protein) 6-os pH-jú 0,025 mólos trisz/maleát pulTerbcn 0,2 mmól CaCI2 és 0,02 mmól radioaktíviin jelzett szubsztrátum - foszfatidil-[,4C’]-izonit - hozzáadása mellett 37 °C-on 5 percig inkubáljuk. A reakciót leállítjuk azzal, hogy CHCl3/CH3OH 2:1 (v/v) arányú eleggyel kirázzuk. Ezáltal a fel nem használt szubsztrátum a szerves fázisba extrahálódik, míg a 14C-izonit-foszfát reakciótermék a vizes fázisban visszamarad és egy alikvot részét radiometriásan megmérhetjük. A vizsgálandó anyagnak a C foszfolipázra gyakorolt gátló hatásának megállapítására ezeket oldat alakjában — vízben, dimetil-szulfoxidban (végső koncentráció a keverékben 5 %-ig v/v) vagy etanolban (végső koncentráció a keverékben 2,5 % v/v) oldva - adagoljuk az inkubációs rendszerhez. A vizsgálandó anyagok hatásfokát az ICgo-érték jellemzi, vagyis az a koncentráció, amely a kontrollaktivitásra 50 %-os gátló hatást gyakorol. Az IC50-t grafikusan határozzuk meg oly módon, hogy a százalékos gátló hatást az ordinátára visszük, az abszcisszára felvett log koncentrációval (/cmól) szemben. A leírt kísérleti körülmények mellett a mepakrin a C foszfolipázt egy 20 /xmólos lC5o-értékkel gátolja. Szabadalmi igénypontok 1 eljárás az (I) általános képlctű vcgyülctck - a képletben R' jelentése 1—3 szénatomos alkilcsoport vagy 1-3 szénatomos olyan hidroxi-alkil-csoport, amelynek hidroxilcsoportja 1—4 szénatomos alkánkarbonsavval észterezett alakban vagy tetrahidropiranil-csoporttal védve lehet, R2 jelentése 3—15 szénatomos telített alifás csoport, vagy 8-12 szénatomos telítetlen alifás csoport, R3 jelentése hidroxilcsoport, 1-4 szénatomos alkoxiesoport vagy -NH-CH2-CO-R3 (-Rj?) általános képlctű szubsztituált aminocsoport, ahol R*v hidroxilcsoport vagy 1—4 szénatomos alkoxiesoport és-X— jelentése egyszeres kötés, metiléncsoport vagy >CH-NH-R4 (-Xo-) általános képlctű, adott esetben N-acilczett primer amino-mctilén-csoport, amelyben R4 hidrogénatom vagy egy polihalogén-(2—5 szénafomos)-alkánkarbonsav acilcsoportja, mimellett a hidroxilcsoport oxigénatomja a kénatomhoz képest relatív transz-konfigurációban van -, valamint a sóképző tulajdonságokkal rendelkező ilyen vegyületek alkálifém- vagy alifás ammóniumsói előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletű transz-epoxidol - amelyben R1 és R* jelentése a fentiekben megadottakkal megegyező és amelyben egy adott esetben jelenlévő hidroxilcsoport védett alakban lehet - egy (III) általános képletű merkapto-alkánkarbonsav-származékkal - ahol R3 és —X— jelentése a fentiekben megadottakkal megegyező és amelyben egy adott esetben jelenlévő aminocsoport védett alakban lehet - reagáltatunk, és amennyiben szükséges vagy kívánt, a hidroxil- és/vagy aminocsoport(ok) védő-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 29
