196263. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai eljárás és készítmény
I 196 263 2 Ligandum Az agglutinátum színe (agglutinált szemcsék) Háttér-szín (nem agglutinált szemcsék) A vörös kék+zöld B zöld kék+vörös C vörös+kék zöld D vörös+zöld kék E vörös+zöld vörös F kék vörös+zöld A fenti eredmények alapján az agglutinátum színe különösen az A, B és F ligandumok kialakulására ás azonosítására alkalmas, míg a háttér-szín különösen a C, D és E ligandumok kimutatására és azonosítására szolgálhat. A találmány szerinti eljárás fentebb ismertetett kiviteli módjai esetében bizonyos esetekben kívánatos lehet a közegnek a vizsgálat lefolytatása előtti előkezelése; az ilyen előkezelés lehet savakkal vagy enzim-kivonatokkal történő kezelés, továbbá szűrés, centrifugálás, hígítás, betöményítés és/vagy melegítés. Melegítés útján például lehetséges a már említett zavaró anyagok dezaktiválása vagy a vizsgálat során mutatkozó aktivitásuk számottevő csökkentése. A szokásos agglutinációs módszernél gyakran alkalmaznak egy kontroll-latexet, amely egy, a vizsgált antigénnel be nem oltott állatból vett immunoglobuiin-frakcióval (a továbbiakban: kontroll-antiszérum) bevont latexrészecskék szuszpenziója, vagy pedig a teszt-latex-szel azonos osztályba tartozó, de eltérő specifikusságú monoklonális antitesttel bevont latex-részecskék. A kontroll-latexnek a teszt-minta jelenlétében bekövetkező agglutinációja zavaró nem-specifikus reakciót jelez. Az ilyen kontrolj-latex reagens alkalmazásának hátránya, hogy a vizsgálandó biológiai teszt-folyadék legalább egy további alikvot-részére van szükség minden egyes vizsgálathoz vagy vizsgálat sorozathoz, mimellett ez a további alikvot-rész azután nem nyújt semmilyen hasznos információt a fertőző ágens azonosítására. A jelen találmány olyan új módszert nyújt az ilyen diagnosztikai vizsgálatok végzésére, amely feleslegessé teszi a külön kontroll-latex alkalmazását és így kiküszöböli az ezzel járó hátrányokat. Emellett a találmány olyan közvetlen agglutinációs módszert biztosít a ligandumok valamely közegben való jelenlétének kimutatására, amely abból áll, hogy a közeget olyan reagenssel elegyítjük, amely 1) bizonyos színű oldhatatlan részecskékhez való kötődés útján oldhatatlanná tett és a keresett ligandumhoz kötődni képes antitestet, és 2) kontroli-szérummal bevont oldhatatlan, de az előbbitől eltérő színű részecskéket tartalmaz, majd megfigyeljük, hogy történik-e agglutináció és meghatározzuk az agglutinált részecskék színét. így a találmány szerinti vizsgálati eljárás egy jellemző példája esetében a vizsgálandó közeget olyan reagenssel elegyítjük, amely a kimutatandó antigén antitestjével bevont kék latex-részecskéket és egy kontroli-szérummal bevont vörös latexrészecskékct tartalmaz. Ha a gyanított antigén jelen van a közegben és zavaró nem-specifikus reakció nem lép fel, akkor kék agglutinátum képződik, vörös háttér mellett. Ha viszont fellép ncm-spccifikus zavaró reakció, akkor mind a vörös, mind a kék részecskék agglutinálódnak és így bíborszerű színű csomók képződnek. Nyilvánvaló, hogy a fenti példában említett kék és vörös részecskék helyett bármilyen más kontrasztot mutató színpár is alkalmazható. A fentebb leírt vizsgálati módszer mellett a találmány további tárgyát a ligandumoknak a fenti eljárással való kimutatására alkalmas diagnosztikai vizsgálati készlet képezi, amelynek lényeges alkotórésze a ke t vagy több különböző színű oldhatatlan színes anyagot tartalmazó reagens, amelyben mindegyik meghatározott színű oldhatatlan anyag más és más specifikus ligandum megkötésére van adaptálva. Ennek a valamely ligandum kimutatására alkalmad diagnosztikai vizsgálati készletnek egyik előnyös kiviteli alakja esetében a reagens 1) bizonyos színű oldhatatlan részecskékhez való kötődés útján oldhatatlanná tett és a keresett ligandumhoz kötődni képes antitestet, és 2) kontroli-szérummal bevont oldhatatlan, de az előbbitől eltérő színű részecskéket tartalmaz. Egy további előnyös kiviteli alak esetében a vizsgálati készletben a reagens két vagy több különböző színű oldhatatlan anyagot tartalmaz, amelyek közül legalább az egyik előnyösen, kettő legalább kétféle specifikus megkötőanyagot tartalmaz, illetőleg legalább egy előnyösen legalább kétféle specifikus megkötőanyaghoz van kötve. A találmány szerinti vizsgálati készlet további alkotórészekként önmagukban ismert és ilyenfajta készletekben szokásos elemeket, mint cseppreakció-lapokat, keverópálcákat, pozitív kontroli-antigént mindegyik vizsgálandó antigénhez, negatív kontroll-.,antigént” (pl. sóoldatot) és a vizsgálati készlet használatára vonatozó utasításokat tartalmazhat. A találmány közelebbi részleteit a következő példák szemléltetik; megjegyzendő azonban, hogy a találmány köre semmilyen szempontból sincs e konkrét példák tartalmára korlátozva. 1. példa Szenzitizált latex előállítása a) Az antitest elkészítése Részlegesen tisztított G-immunoglobulint immun nyúlszőrömből állítunk elő, oktánsawal (BDH Chemicals Ltd.) való kezelés útján, Steinbuch és Audran (Arch. Biochcm. and Biophys, 134, 279—284 (1969)] módszere szerint. b) Az antitest kötése a színes latexhez 5,0 mg színes latexhez (Estapor, K58, 0,2 p, polisztirol, fekete, vörös, kék, sárga vagy zöld, Rhone Poulenc, 82 00 485 sz. közzétett francia szabadalmi bejelentés, 85 016 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés) 600 pn antitestet adunk 1 ml glicines sóoldatban (pH = 8,2 0,1 mól glicin 0,85%-os nátrium-klorid-oldatban, pH nátriumhidroxiddal beállítva). A latex és az antitest elegyét 30 percig melegítjük 56°C hőmérsékleten. Szobahőmérsékletre való lehűlés után marha-al-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
