196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával

1

196 242

2

Szűrök:

pKTHIO plazmidból származó a-amiláz gén EcoRI-BamHI fragmentuma (0,35 pg)

2) 1 pg borjú-thymus-DNS

3) Vakpróba (DNS nélkül)

Jelzett nukleinsavreagens:

10

A pKTHIO plazmidból származó a-amiláz gén Qal—EcoRI fragmentuma, fajlagos aktivitása 35 x10s cmp/pg/200000 cpm ^/-reakció.

15

Hibriáizálás:

Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.

20

Mosás:

Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.

25

Minták:

A baktériummintákat 67 pg/ml Iizozimmel 37 ÖC hómérsékleten 30 percig kezeltük; az E coli. mintákhoz 5 mmól EDTA-reagenst is adtunk. E 30 kezelés után az összes mintához SDS-t adtunk (végkoncentrációja 2%), és a mintákat kétszer egy finom tűn vezettük át viszkozitásuk csökkentése végett, majd forralással denaturáltuk, ahogyan ezt a minták kezelésére vonatkozó szövegrészben leír- 35

tűk.

5. Táblá

A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hogy ugyanígy elvégeztük a hibridizálást minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értékeket levontuk.

5. példa

Példa a sandwich hibridizáldsi eljáráson alapuló reagenskombináció-készlctrc (5. táblázat)

E vizsgálatunkban alkalmazott minták háromféle vírussal (adenovirus, SV40 vírus és Herpes simplex) fertőzött sejtek voltak, továbbá egy olyan minta, amely Bacillus amyloliquefaciens baktériumokat tartalmazott. Egyidóben minden egyes mintához hozzáadtuk az alább következő reagenseket: négy szűrót, amelyet az SV40 vírusból, adenovfrusból, Bacillus amyloltquefaeiens'a-amiláz génből és borjú-thynusból származó DNS egyikét tartalmazták, továbbá egy DNS-t tartalmazó szúrót; ezt követően hozzáadtuk a következő, jelzett nukleinsav-reagenseket (200000 cpm fajlagos aktivitással): SV40 vírus-, adenovirus- és a-amiláz gén-DNS-reagens.

Példánk azt mutatja, hogy lehetséges a minta felosztása és hígítása nélkül a mikróbák alkalmas sorozatának egyidejű vizsgálata ügy, hogy a mintához reagenskombinációt adunk. A minta mind vírusból, mint baktériumból származó nukleinsavat tartalmazhat. A szúrók megjelölhetők (címkével, befogószerkezettel), és ezzel azonosítható az a szekvencia, amelyet a szűró tartalmaz és az a mikroba, amely a szűrőre kötődik (hibridizál). A szűrők jelölhetők számokkal vagy betűkkel, például: 1 vagy SV40^2 vagy Ad, stb. vagy más jelzésekkel, például a SV40 esetében; A Ad esetében; _

:at

A szűrők hibridizáíási eljáráson alapuló készlet

Szúrók (cpm)

Minta

1) SV40

2)Adeno- 3) a-amivfrus láz

4) Borjúthymus

5) Vakpróba

SV40 vírussal fertőzött sejtek /106 sejt/

18 390

2

13

22

31

2. típusú adenovírussal

ferózött sejtek (6x 10s sejt)

—

8750

5

13

—

Herpes simplex vírussal

fertőzött sejtek (10* sejt)

—

—

—

5

13

Bacillus amyloliquefaciens

(KP sejt)

15

8

6500

16

5

Nem fertőzött sejtek

—

—

—

—

Szűrők:

1) A 3. táblázathozodott leírás szerint.

' 2) Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.

3) A 4. táblázathoz adott leírás szerint.

4) 1 pg borjú-thymus-DNS

5) Vafcpróba (DNS nélkül)

a-amiláz gén: a 4. táblázathoz adott leírás sze- 55 rint.

Hibridizálás:

Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.

60

Mosás:

Jelzett nukleinsavreagensek:

Az 1. táblázathoz adott leírás szerint.

SV40 vírus: a 3. táblázathoz adott leírás szerint, 65 Minták:

Adenovirus: az 1. táblázathoz adott leírás szerint, Az SV40 vírussal, illetve adenovírussal fertőzött

8