196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával
A, találmány tiigya eljárás mikroorganizmusok azonosítására nöklemsavnak szilárd hordozón való ^jandwich^ hibriórzálása útján. A találmány aZ eljárás sotánal^almacott feagenskombinációra és ' vonatk(aik%> ... A mikrobát hagyományos azonosítására (diag> nosztikájajTs^rán egy mikrobának adott mintában való jelenlétét a kérdéses mikroba elkülönítésévet (aoláláaáv£lYmtttatják ki. Dúsító tenyésztés után a mikrobát biokémiai sajátságai vagy immunológiai módszerek segítségével azonosítják. Ez az azooosítáatmódszer megköveteli, hogy a mintában levő mikrgbfttlöállapotbán kegyen. Az elkülönítés Útján véglett .azonosítás erősen időigényes, és YÍn*SolCeOTtéí>en4—6 hetet is igénybe vehet. B találmány célja olyan azonosítási eljárás(diag* nosztikatn)4ds2?0 biztosítása, amelyek során egy mikrolaiana* iíidott mintában való jelenlétét úgy mutatjuk kj^iogy genetika* anyagát, a nukleinsáyat az érzétopy és specifikus nukleinsav-hibridizár Jtósi módszer- igítségévél azonosítjuk. A nukleiusavak hibHdizátása önmagában véve régi és jó) ismert rnódssp pukleinsavak azonosságának vizsgálatára, A komplementer nukleinsavszálak ázzál a képességgel rendelkeznek, hogy a bázispárkép? Zés szabályainak megfelelően szoros kettősszám szerkezetet gjkqjnak, és az így keletkező hibrid a megmaradt égyszálú nukleinsavtól elkülöníthető. Néhány otyan eljárást, amely nukleinsav(ak) azonosítását* alapul, már eddig is felhasználtak mikrobák azonosítására. A bélre toxikus Escherichia co&t .székletmintákban úgy azonosították, hogy a toxin termeléséért felelős gén felhasználásával kolóuiahibrjdizálást végeztek. A pozitív hibridizálást aitforadiográfiával igazolják (Moseley, S. L. és munkatársai: J. Infect. Dis. 142, 892 (19®)). A kolónia-bibridizálás az eredetileg Grúnáiéin ét Hogness által felfedezett módszeren alapszik (Proc. Nath Acad. Sei. USA, 72, 3961 (1975)). A bibrjdizálást a Herpes simplex 1. és 2, típusának megkülönböztetésére is alkalmazták (Bräutigam, A. R. és munkatársai: J. Clin. Microbiol. 12, 224 (1980)), de nem gyors diagnosztikai módszerként, hanem a vírus típusának felismerése céljából, dúsító tenyésztés után. Ezen eljárás során a kettősszálú hibridet az oldatban megmaradó, égyszálú uuk'efnsavak frakciójától affinitási kfomatográfm segítségével különítik el. Újabban közölték, hogy Epsetin-Barr vírussal (a mintában) fetózött sejtekből a dezoxiribonukleinsavat (a következőkben: DNS) megfelelő előkezelés után közvetlenül a szűrőkön rögzítették. A kérdéses miklelnsavat úgy azonosították, hogy a szűrőket a radioaktív mintával hibridizálták, és a pozitív hibrjdizálást autoradiográfiával mutatták ki (Brandsma, I. és Miller, K.: Proc. Nah. Acad. Sei. USA, 77, 6851, (1980). Hasonló-eljárást közöltek a 2950995 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásban és a Lancet 1981. október 10-i számának 765 —767 oldalain. Az idézett szabadalmi leírásban eljárást ismertettek radioaktívan jelzett DNS minta előállítására a rekombináns DNS mószer segítségével. E DNS mintát hepatitis B vírusból készítettek, A „Lancet” idézet szerint e mintát felhasználták a hepatitis B vírus kimutatására. Az eljárás során a mintából vett DNS-t nitrocellulózból szűrőre vitték át, és a mintából a szűrőre rögzített hepatitis DNS-t a radioaktív DNS-minta reagensként való alkalmazásával mutatták ki. Mivel találmányunk szerint két reagenst alkalmazunk, elj^r&unk (módszerünk) sokkal érzékenyebb, mint a fenfttebb leírt módszer, éslehetővé teszi különböző készletek megszerkesztését, amelyek segítségével különböző mikrobák vagy mikrobacsoportok ugyanazon mintában kimutathatók anélkül, hogy ez a kérdéses mikrobák vagy mikrobacsoportok kimutatásának specifitását befolyásolná. A találmány szerinti eljárás során két különböző nukleinsavfragmentumból álló reagenst — amelyek közül az. egyik a szilárd hordozóhoz kötődik, a másik pedig megfelelő módon jelezve van — alkalmazunk, és a mintából származó DNS a folyadékfázisban Van. Találmányunk a sandwich hibridizálási módszeren alapul (Dunn, A. R. Hassel, J. A.: Cell 12,23 (1977)/ és egyszerűsíti a minta kezelését és a hibrid kimutatását. Ennek következtében a találmány szerinti eljárás különösen alkalmas mikrobák azonosításába (diagnosztikájára). A találmány szerinti eljárás során az összes, kívánt mikrobák vagy mikrobacsoportok azonosíthatók, egyetlen olyan minta felhasználásával — a minta osztása nélkül — amefy denaturált állapotban tartalmazza az azonosítandó mikrobák vagy mikrobacsoportok égyszálú nykleinsavait. Az eljárás minden egyes azonosítandó mikroba vagy mikrobacsoport számára két nukleinsavreagenst igényei. E reagensek két olyan különálló nukleinsavfragmentumok, melyek az azonosítandó mikroba genómájából származnak, s amelyeknek közös szekvenciájuk nincsen, azonban a genómában egymáshoz igen közel helyezkednek el. E reagensek előállíthatók közvetlenül a mikroba genómájából vagy rekombináns DNS módszer alkalmazásával. A nukleinsavfragmentumok egyikét denaturálás után egy szilárd hordozóhoz, előnyösen egy nitrocellulózszúröhöz rögzítjük, a másik nukleinsavfragmentumot — szintén égyszálú alakban — megfelelőjelzéssel látjuk el. Ha ezeket a nukleinsavreagenseket, azaz minden egyes azonosítandó mikroba vagy mikrobacsoport számára két különböző reagenst érintkezésbe hozzuk a mintában azonosítandó, égyszálú nukleinsavakkal, akkor a nukleinsavak a a szilárd hordozóhoz kötött, kompié? menter nuklemsavfragmentumokkal összeforrnak („anneal”). A szilárd hordozón így kialakult hibridek a jelzett, komplementer nukleinsavfragmentumokkal való összeforrasztás /„anneal”) után jelzetté válnak. A jelzett nukleinsavfragmentumok önmagukban nem hibridizálnak a hordozóhoz kötött nukieinsavfragmentumokka], hanem csupán a mintából származó, megfelelő égyszálú nukleinsavakkal. Ennek következtében csak azok a hordozók válnak jelzetté, amelyekkel a mintából származó, komplementer nukleinsavak hibridizálták. Ezek a hordozók könnyen kimoshatók, és ezt követően a jelzés erőssége ismert módszerek segítségével mérhető. A találmány szerinti eljárás elvileg az összes DNS-t vagy RNS-t tartalmazó organizmusok — így például vírusok, baktériumok, gombák és élesztők — azonosítására alkalmazható. A módszer különleges előnye, hogy az összes, számbave-5 10 15 ,20 25 30 35 40 45 50 55 (30 55
