196241. lajstromszámú szabadalom • Biotechnológiai eljárás kobamid származékok előállítására
1 196241 nak) elhagyásával űj, anaerob, mezofil, metántermeló vegyes mikropopuláciö alakul ki, [amelynek törzseit az Országos Közegészségügyi Intézet — Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél 90076, 00079 és 00272. szám alatt deponáltuk; az 5 egyes törzsek neve és jelzése a felsorolás sorrendjében: Corynebacisrhsm sp. (jelzése: 24A1), Propionibacterium sp. (jelzése; 239 A,/6) és Metanoecoccussp. (jelzése: MC—017)], amelllyel az időegység alatt termelhető hatóanyag mennyisége 20—30% - 10 kai nagyobb, A III, faktor kocnzunet, illetőleg a Ul. faktort ezideig a következő mikroorganizmusokból izolál- y ták, illetőleg állították elő: — Methanobadllusomeiianskii, jS — Escherichia coli 113—3 (F. M, Robinson, 1, M. Miller, J, F. McPherson, K. Folkers: J. Amer. . Chem. Soc., 77.5192,1955.), — Methanobacterium bryantii (W. B. Whitman, R. S. Wolfe: Anal. Biochem., 137 111, 261, ! 20 1984), — Propionibacterium schermanii (P. Renz: Methods Enzymol., 180. 82,1971.); R. Wurm, R. Weyhenmeyer, P, Renz: Eur. J. Biochem., 56. 427,1975.), 25 — Methanosarcina barkeri (A. Pol. C. yan der Drift, G. D. Vogels: Biochem. Biophys. Rés. Commun., 108(2). 731,1982.), — rothasztott szennyvíziszap (W. Friedrich, K. Bernhauer: Z. Naturforschg., 11b. 68,1956.), 30 — szennyvíziszap eredetű, anaerob, mezofil, metántermelő vegyes ' mixropop^láció (151065, 153740, 159356, 167658, 168293, 176313, 188954, és 188955 sz. magyar szabadalmi leírások). 35 Alii. faktor bioszintézisét F. Schererés munkatársai foglalták legújabban össze (P. Scherer, V. HöHriegel, C. Krug, M. Bokel, P. Renz; Arch, Microbiology, 138/4/. 354,1984.). A technika állásának ismeretében, — különös 40 tekintettel a rothasztott szennyvíziszap' eredetű, anaerob, mezofil, metántermelő vegyes mikropo jpulációkka! eddig elért eredményekre — a találmányunk célkitűzése olyan biotechnológiai eljárás kidolgozása, amelyben 4b — a 188954, illetve a 188955 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett anaerob, mezofil, metán termelő, vegyes míkropopulációból vagy a rothasztott szennyvíziszapból kiindulva a fermentlé III. faktor koenzim hozamát — akár a Bu koenzim 50 kárára is — növeljük, illetve -* a baktériumsejtekben képződő III. faktor koenzim és B,2 koenzim arányát — az igényeknek megfelelően — változtatjuk. Kísérleteink során azt találtuk, hogy célkitűzé- 55 sünk megvalósítható, ha a 188 954, illetve 188955. sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett tápanyagokat tatalmazó olyan tápközeget alkalmazunk, amelyben csupán a prekurzor(oka)t változ tatjuk. Továbbmenőleg azt is felismertük, hogy go előnyösebb, ha a rothasztott szennyvíziszapból, és nem a B12 koenzim fermentlevéböl indulunk ki, ez esetben ugyanis hamarabb „áll át” a 188954. sz, szabadalmi leírás szerinti vegyes mikropopuláciö a III, faktor termelésére. 65 Igen figyelemre rocltó az a felismerésünk is, hogy a prekurzor(ok) változtatásával a kialakult vegyes mikropopuláciö a 188954. sz. szabadalmi U írás szerinti törzseket tartalmazza, a mikropopuláció összetétel tehát nem a prekurzor(ok)tól függ, . hanem egyedül a tápanyagok összetételeitől (i.67 658. és 188954. sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett vegyes mikropopuláciö). A találmányunk tehát abban különbözik az eddig ismert eljárásoktól, hogy — a III. faktor (koenzim) ezideig az anaerob, szeptikus körülmények között mezofil, metántermeiő, vegyes mikropopulációval végzett fermentálás során csupán melléktermékként keletkezett a B,, viíaijiin (koenzim) gyártásánál, mint a korrir oidok egyik spontán intermedieije, —3,4-dinitro-fenol prekurzort ezideig még nem alkalmaztak e biosziniázisben, továbbmenőleg még a rnetanogénekre kifejtett hatását sem vizsgálták, — 3,4-diamino-fenol toxieitását ugyan vizsgálták, de a bioszintézisben nem alkalmazták, — az 5-hidroxi-benzimidazolt ugyan steril fermentálásban már alkalmazták, de az előbb említett anaerob, szeptikus körülmények között nem, ~ ezideig nem állt olyan flexibilis eljárás rendelkezésre, amely szerint a III. faktor és a Bl2 vitamin arányát tetszőlegesen lehetett volna változtatni. A találmányunk szerinti eljárás értéke főként abban foglalható össze, hogy kellő igény esetében nagyüzemi méretben a tápközeg, pontosabban csupán a prekurzorok kellő megváltoztatásával ÓI. faktort, vagy III faktort és Bl2 vitamint lehet előállítani a Bu koenzimeí fermentáló nagyüzemben a berendezés legcsekélyebb változtatása nélkül. Találmányunk tehát egy esetleg felmerülő szükségletet old meg. A találmány eljárás 5-hidorxi-benzimidazolü-kobamid koenzim, vagy 5-hidorxi-benzimidazolilkobamid, kívánt esetben, 5,6-dimetii-benzimidazolií-kobamid kóenzimmel, vagy 5,6-dimetil-benzimidazolil-kobamiddal való együttes előállítására részben ismert prekurzor(oka)t tartalmazó tápközegben 24 A jelzésű Coryaebacterium sp., 239 Aj/6 jelzésű Propionibacterium sp. és MC—017 jelzésű Metanococcus sp. fajokból álló mezofil, mélán termelő vegyes mikropopulációval anaerob, szeptikus körülmények között végzett fermentálás útján, oly módon, hogy prekurzorként — 5-hidroxi-benzimidazolt, vagy — 3,4-diamino-fenolt, vagy — 3,4-diíiitro-fenolt és kívánt esetben — 5,6-dimetil-benzinhdazolt alkalmazunk, és a kapott 5-hidroxi-benzitnida20- lil-kobamid koenzimet tartalmazó sejteket kinyerjük, kívánt esetben cianidion jelenlétében ismert módon feltárjuk. Találmányunk szerint egy térfogat tápközeghez, amely tf% metanolt, tf% hökezelt kukoricalekvár oldatot (hidrolizátumot) és/vagy hókezeli kukoricamoslékot, v% ammónium-hidrogén-karbonátot, 0,01—0,03 v% magnézium-kloridot, 0,0001 - 0,002 v% kobalt-kloridot, 0,3-0,8 1,0-4,0 0,25-0,7 3
