196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196 239 2 kai szeles körben használhatjuk, és kielégítik az. igényt előnyös. Strcptomyces törzsek és rokon mikroorganizmusok megfelelő klónozó hordozói iránt. A találmány szerinti vektorok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosítanak, ezek az antibiotikumok toxikusuk a nem transzformált gazdasejtekre, így funkcionális módszer! biztosítanak a transzformansok szelektálására. Ez azért fontos, mivel így mód nyílik a vektor dezoxiribonukleinsavat felvett egyes sejtek meghatározására és szelektálására. A találmány szerinti eljárással olyan további dczoxiribonuklcinsav-szegmensek építhetők be a találmány szerinti vektorokba és ezután a nem szelektálható dezoxiribonukfeinsavat tartalmazó transzformánsokba, amelyek jelenléte egyébként nem mutatható ki, mivel a megfelelő antibiotikumra való szelektálással izolálhatok. Ilyen, nem szelektálható dezoxiríbonukleinsavszegmensek például, de nem limitáló felsorolással olyan gének, amelyek antibiotikumot módosító enzimeket és mindenféle típusú regulációs géneket határoznak meg, illetve tartalmaznak. Részletesebben, egy gént tartalmazó, nem szelektálható dezoxiribonukleinsav-szegmenst építünk be egy plazmádba, például a pELl 13 plazmidba, az 1,6 kb. nagyságú BamHI rezisztenciát hordozó fragmens Sáli restrikciós helyére. Ez a beépítés inaktiválja a tiostrepton rezisztencia gént. és így könnyen szelektálhatjuk azokat a transzformánsokat, amelyek a rekombináns plazmidot tartalmazzák. Úgy járunk el, hogy először neonácin rezisztenciára szelektálunk, majd azonosítjuk azokat a neonácin rezisztens transzformánsokut, amelyek tiostreptonra érzékenyek. Hasonlóképpen, ha a 3,4 kb. nagyságú, rezisztenciát meghatározó BamHI fragmens BamHI restrikciós helyére egy dezoxiribonukleinsav-szegmenst építünk be, úgy a neomicin rezisztencia gén inaktiválódik. A rekombináns plazmidot hordozó transzformánsokaí könnyen azonosíthatjuk oly módon, hogy először tiostrepton rezisztenciára szelektálunk, majd ezt követően azonosítjuk azokat a tiostreptonra rezisztens transzformánsokaí, amelyek neomicinrc érzékenyek. Ily módon lehetőség nyílik olyan Strcptomyces és rokon ejtek szelektálására, amelyek antibiotikumra rezisztensek, és ezzel hatékonyan izolálhatunk olyan, igen ritkán jelentkező sejteket, amelyek tartalmazzák a számunkra érdekes, nem szelektálható dezoxiribonukleinsavat. A fentiekben ismertetett antibiotikum rezisztencia funkcionális teszt felhasználható további olyan dezoxiribonukleinsav-szegmcnsck kutatására, amelyek kontroll elemként, és egy adott antibiotikum rezisztencia gén közvetlen kifejezése kapcsán működnek. Ilyen szegmensek például, de nem limitáló felsorolásként, az alábbiak: promotcrck, attenuátorok, represszorok, induccrek, riboszómális kötőhelyek és hasonlóak, amelyek más gének kifejezésének szabályozásakor játszanak szerepet a Strcptomyces és rokon mikroorganizmusok sejtjeiben. A találmány szerinti vektorok tiostrepton és neomicin rezisztenciája felhasználható arra. hogy bizonyossá tegyük azt, hogy a beépített dezoxiribonukleinsav-szegmcnsek stabilan megmaradnak a gazdasejtben, több generáción át. Ezeket a tiostrepton- vagy neomicin-rezisztenciát meghatározó (ragmensekhez kovalensen kapcsolt géneket vagy dezoxii ibonukleinsav fragmenseket Streptomyccs \agy rokon mikroorganizmusok sejtjeiben! szaporítjuk, oly módon, hogy a transzformánsokut tiostrepton vagy neomicin jelenlétében növesztjük. mégpedig olyan mennyiségű antibiotikum jele délében, amely a nem transzformált sejtekre toxikus. Ily módon azok a transzformansok, amelyek elveszítették a vektort, és ezért bármely kovalensen kapcsolt dezoxiribonukleinsavat, nem képesek növekedni, és eliminálódnak a tenyészetből. A találmány szerinti vektorok ily módon stabilizálhatok, és bármely érdekes dezoxiribonuk'cinsav-szekvencia fenntartható. A találmány szerinti klónozó vektorokat és trarszformánsokat gének klónozására használhatjuk. ennek következményeképpen a Streptomyces törzsek és rokon sejtek által termelt különböző anyagok termelését növelhetjük. Ilyen termékek például, de nem limitáló felsorolásként, a következők sztreptomicin, tilozin, cefalosporinok, aktaplanin. narazin, monenzin, apramicin, tobramicin, érit omicin és mások. A találmány szerinti eljárással előállíthatunk olyan szelektálható vektorokat is. amelyeket felhasználhatunk gazdasági szempontból fontos fehérjék, például a humán inzulin,' a humán proinzulin, a glukagon, az interferon és] mások termelését meghatározó információk klónozására, jellemzésére és az ezeket meghatározó] dezoxiribonukleinsav-szekvenciák előállítására.’ Felhasználhatjuk a vektorokat gazdasági szemportból fontos folyamatok és vegyületek keletkezésére vezető, az anyagcsere folyamatokban részt vevő enzim funkciók vagy a génkifejeződést fokozó szabályozó elemek átvitelére is. Ilyen előnyös dezoxiribonukleinsav-szekveneiák például, de nem limitált felsorolásként, az olyan dezoxiribonukleinsavak, amelyek antibiotikum-származékok szil tézisét katalizáló enzimeket határoznak meg,, például az alábbi antibiotikumok esetén: sztrepto-1 micin, ceíaiosporin, tilozin, aktaplanin, narazin, monenzin. apramicin vagy eritromicin. Felhasználhatók a vektorok olyan enzimek átvitelére is, amelyek szabályozzák és növelik antibiotikumok vagy más termékek biotermelését. A találmány szerinti eljárással való dezoxiribonukleinsav-szegmens beépítése és stabilizálása ily módon lehetővéteszi a Strcptomyces vagy más rokon mikroorganizmusok által termelt antibiotikumok hozamának növelését. Streptomyces granuloruber A39912.13/pELl03 törzset különböző körülmények között, különböző táptalajokon tenyésztjük. A táptalajba szénforrásként például melaszt, glükózt, dextrint és glicerint, nitrogénforrásként pedig például szójalisztet. am nosavakat és peptonokat adunk. A táptalajba adagolhatunk közönséges sókat is, előnyösen olyanol at. amelyek nátrium-, kálium-, ammónia-, kalcium-. foszfát-, klorid-szulfátionokra vagy más. hasonló ionokra disszociáltnak. A táptalajhoz a mii roorgnnizmus növekedését és fejlődését elősegítő nyomelemeket is hozzáadjuk. Ezek a nyomelemek a táptalaj többi komponensében általában szennyezőanyagként jelen vannak. A Strcptomyces granuloruber A39912.13/ pE: .103 mikroorganizmust levegőztetett körülmények között. viszonylag széles pH-intervallumban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
