196239. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyceshez és rokon mikroorganizmusokhoz használható klónozó vektorok előállítására
1 196239 2 a pÍJ43 plazmid 2,8 kb nagyságú Sail fragmense, a 2,7 kb nagyságú Sail—BamHI fragmense, a 3,0 kb nagyságú Hindlll fragmense, a 2,5 kb nagyságú Sail—Bglll fragmense, a 2,8 kb nagyságú Xhol— Bglll fragmense, és a 4,1 kb nagyságú EcoRI — BamHI fragmense. A pIJ43 plazmid előállítható az E. coli 803/pJJ43 törzsből, a baktérium az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, törzsgyűjteményébe van letétbe helyezve. Innen ATCC 39156 számon kérhető el. Előállíthatjuk a fenti antibiotikum-rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmensek különböző funkcionális származékait oly módon is, hogy a szegmensekhez hozzáépítünk, a szegmensekhez lehasítunk vagy helyettesítünk bizonyos nukleotidokat. Ezen származékok vagy más antibiotikumok-rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmensek hozzákapcsolása a repükációs origint tartalmazó pEL103 plazmidhoz a jelen leírásban példaként megadott rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmensek helyett, olyan vektorokat eredményez, amely a jelen szabadalmi leírás oltalmi körén belül esik. A találmány szerinti eljárás értelmében további vektor-származékokat is előállíthatunk. így például, ha a pEL105 plazmidból kihasítjuk a Bell — BamHl restrikciós szakaszt, úgy megkapjuk a pFJ124 jelű plazmidot, amiből viszont további származékok állíthatók elő. Például, ha ebbe a pFJ124 plazmidba beépítjük a pLRl vagy pLR4 3,4 kb nagyságú, BamHI neomicin rezisztenciát meghatározó restrikciós fragmenst, úgy megkapjuk a pFJI44 és pFJ145 plazmidokat. Ha a pFJ144 plazmidból kihasítjuk a Bclí—BamHI fragmenst, úgy a pFJ146 plazmidhoz jutunk. Ha a pIJ43 plazmid 2,7 kb nagyságú Sáli — Bgllí eritromicin rezisztenciát meghatározó restrikciós íragmensét beépítjük a pFJ124 plazmidba, úgy megkapjuk a pFJ147 jelű plazmidot. Hasonlóképpen, ha a pIJ43 2,0 kb nagyságú Sail eritromicin-rezisztenciát meghatározó fragmensét használjuk, úgy megkapjuk a pFJ148 és pFJ149 plazmidokat. A fenti, antibiotikum rezisztenciát meghatározó gént tartalmazó plazmidok tartalmazzák továbbá a ;)EL103 plazmidot replikációs originjéí, így a találmány oltalmi körén belül esnek. Mind a pEL103 plazmid restrikciós fragmensei, mind pedig a különböző antibiotikum-rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmcnsck módosíthatók a ligálás (kötés) elősegítésére. így például molekuláris linkereket (kötőmolekulákat) kapcsolhatunk az egyes pELi03 restrikciós íragmensekhez és/vagy az antibiotikum-rezisztenciát meghatározó dezoxiribonukleinsav-szegmensekhez. Ily módon a ligádéhoz specifikus helyeket állíthatunk elő. Ezenkívül a tulajdonságok megváltoztatására és dezoxiribonukleinsav ligálásához szükséges különböző restrikciós helyek kiépítésére a pELt 13 plazmádról és a repükációs origint tartalmazó pEL103 fragmensekről lehasíthatunk, ezekhez hozzáadhatunk vagy helyettesíthetünk bizonyos nukleotidokat. A szakember számára érthető a nukleotíd kémia és a genetikai kód, továbbá érthető, hogy mely nukleotidok cserélhetők, és milyen dczoxiribonukleinsav-módosítások előnyösek különleges célok elérése érdekében. A találmány szerinti vektorokat, például a pEL103, a pELl()5. pEL109, pEL113, pEL104, pELlll, pELl 17, pFJ124, pFJ144 és a PFJ147 plazmidok hozzáköthetők olyan E. coli plazmid' restrikciós fragmenshez, amely funckionális repli-' kent é.s antibiotikum-rezisztenciát meghatározó szakaszt tartalmaz. Ilyen plazmid például a pBR322, pBR324, pBR325 és pBR328 plazmid.' Ily módon bifunkcionális plazmidok jönnek létre,; ezek felhasználhatók E. coli és Streptomyces sejtekben. Ezek a plazmidok, ilyen például a leírásban példaként említett pEL12I, pEL122, pFJ150 és: píJ!5l különösen előnyösek, mivel a plazmidok: sokszorosítása és az ezekkel való manipuláció gyorsabban és kényelmesebben vitelezhetó ki E. coli-, ban, mint Streptomyces sejtekben. így, miután aj kívánt rekombináns dezoxiribonukleinsav technikákat az E. coli gazdasejt-rendszerben kiviteleztük, az egyes Streptomyces dezoxiribonukleinsavakaf elkülönítjük, újra plazmid alakot készítünk és ezt követően megfelelő Streptomyces vagy ezzel rokon’ gazdasejtet transzformálunk. A találmány szerinti rekombináns dezoxiribonukleinsav klónozó vektorokat, ami használatukat illeti, nem limitáljuk egyetlen fajra vagy Streptomyces törzsre. A vektorok ugyanis széleskörűen hasz-j nálhatók, és számtalan Streptomyces fajba transz-J formálhatók, különösen az olyan, ipari szempont-! ból jelentős, restrikció-mentes törzsekbe, amelyekj antibiotikumokat termelnek, például amino-glüko-j zidot, makrolidot, ß-laktamot, poliétert és gliko-i peptid antibiotikumokat. Az ilyen restrskció-hiá-: nyes törzseket könnyen szelektálhatjuk és izolálhatjuk a Streptomyces törzsekből, az izolálás ismert módon történik (Lomovakaya és munkatársai, Microbiological Reviews, 44, 206, 1980). A vestrikciómentes törzsek sejtjei nem tartalmaznak restrikciós enzimeket, és ezért a transzformáció során nem hasítják vagy degradálják a plazmid dezoxiribonukleinsavat. A találmány leírása soráni azokat a törzseket, amelyek olyan restrikciós enzimeket tartalmaznak, amelyek nem hasítják a leírás szerinti vektorokban levő bármely restrikciós he-: lyet szintén restrikciómentes törzsekként szerepeltetjük. '■ Az alábbiakban ismertetjük azokat a Streptomyces törzseket, amelyek amino-glükozid típusú antibiotikumokat termelnek, és amelyeket különösen, előnyösen transzformálhatunk a találmány szerinti vektorokkal (ideértjük ezen törzsek restrikciómentes sejtjeit is): S. kanamyceticus (kanamícinek), S. chrestomyceticus (aminoszidin), S. griseoflavus (MA 1267 antibiotikum), S. microsporeus (SF—767 antibiotikum), S. ribosidificus (SF733 antibiotikum), S. flavopersicus (spektinomicin), S. spectabilis (aktinospektacin), S. rimosus forma paromomycinus (paromomicin, katenulin), S. fradiae var. italicus (aminoszidin), S. bluensis var. bluensis (bluensomicin), S. catenulae (catenalin), S. olivoreticull var. cellulophiius (desztomicin A), S. tenebrarius (tobramicin, apramicin), S. iavendulae (neamicin, S. algobriseolus (neomicinek), S. albus vará metr.mycinus (metamicin), S. hygroscopicus var. sagamiensis (spektinomicin), S. bikiniensis (sztreptomicin). S. griseus(sztreptomicin), S. erythrochromogenes var. narutoensis (sztreptomicin), S. poolensis (sztreptomicin), S. galbus (sztreptomicin), S. rameus (sztreptomicin), S. olivaceus (sztreptomi-5 10 15 20 " j 30 35 40 45 50 55 60 65 4
