196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
1 196238 2 ,az SV40 nagy T-antigcnjc jelenlétében képesek a replikációra fvö.: Mycrs és Tjian: Proc. Natl.' lAcad. Sei. (USA) 77, 6491 (1981); Lusky és Botéban: Nature 293, 79 (1981)]. Olyan vektorok megszerkesztése volt kívánatos, amelyek mind a replikúciós, mind a promotor-funkciót megtartják. Kimutattuk azt is, hogy egy ilyen rendszer alkalmazható heterológ gének komplementer segítő-vírus távollétében történő expressziójára. A találmány részletes leírása A VP—1 fehérje kódolási tartománya nélküli SV40 DNS felépítése Az SV40 DNS teljes nukleotid-szekvenciája már ismeretes [N. H. Acheson a J, Toozc által szerkesztett Molecular Biology of Tumor Viruses e. műben, Cold Spring Harbor Lab. N. Y. 2. kiadás, 2. rész, 125—204 old. (1980)], ezért a különböző SV40-kódolt fehérjék fizikai helyei közvetlenül korrelációba hozhatók a különféle resztrikciós enzimes hasítási helyekkel. A VP— 1 fehérje kódolási tartományát körülvevő nukleotid-szekvcncia Vizsgálata (N. H. Acheson fent idézett munkájában) két jól definiált resztrikciós endonukieáz-ha- SÍtási hely jelenlét mutatta (1. ábra). Ezek közül az. plső egy HindU] resztrikciós endonukleáz-hasítási hely a 1493 nukleotid-helyzetben, hat 5'-nuk!cotidra a PV—1 fehérje iniciálé kodonjától. A második egy BamHl resztrikciós endonukleáz-hasítási hely a 2533 nukleotid-helyzetben, 50 5'-nuk!eotidra a VP— 1 fehérje terminációs kodonjától. Abból a célból, hogy SV40 DNS-t kapjunk az 1493-nál levő Hindiit hely és a 2533-ná! levő BamHl hely közötti rész elhagyásával, az l. ábrán szemléltetett kísérleteket folytattuk le. Ez röviden úgy történt, hogy vad-típusú SV40 DNS-t először ZíaoiHI-val hasítottunk, hogy így megkapjuk a teljes hosszúságú lineáris DNS-t, azután ezt //mdlll-mal hasítottuk olyan körülmények között, hogy az egyes DNS-molekulák átlagosan csak egy hasítást szenvedjenek (hat Hindin hasítási hely van, az SV40 genom hosszában elosztva). Elméletileg az így enzimes kezelés útján kapott 12 DNS-elegyből egy mutatná a kívánt kombinációt. Ezután a dAGCTGAATTC szintetikus dekanukieotidot |R. Crca és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 75, 5765 (1978)] kapcsoltuk az így BamW és Hindii] enzimmel kezeit SV40 DNS-hez a HindlU hasítási helyeknek (—TCGA) és a dekanukleotidoknak a kohezív végein keresztül. Az egész elegyet azután EcoRI enzimmel kezeltük (hogy kohezív véget hozzunk létre az EcoRI helyen a hozzáadott nukleotidon) és pBR322-höz klónoztuk a Bum és EcoRI helyek [D, V. Goeddel és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76, 106 (1979)] útján. Az SV40 szekvenciákat tartalmazó plazmid DNS-t azután resztrikciós analízis útján [R. W. Davis és munkatársai: Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 116—125 old. (1980)] szűrővizsgálatnak vetettük alá, a kívánt deléciót mutató fragmentet elkülönítettük és pSVR elnevezéssel jelöltük meg. Az említett szintetikus dekanukleoíid hozzáadásának két célja van. Egyrészről a hozzáadott dekanukieotid hasítási helyet tartalmaz az EcoRI resztrikciós endonukleáz számára; az SV40 DNS e részében nincsen ilyen hasítási hely. Ezért a kívánt SV40 DNS vektor-fragment könnyen nyerhető nagy mennyiségekben a pSVR plazmid E. coli mikroorganizmusban történő tenyésztése [D. H. Hamer és P. Leder: Cell, 18, 1299 (1979)], majd EcoRI és /fami II cndonukleázzal való hasítás útján. Másrészről a hozzáadott dekanukleotid helyreállítja az eredeti fizikai távolságot a HindlU hasítási hely és a VP—1 fehérje iniciálé korionja között, ha valamely idegen gén kódoló szekvenciáit tartalmazó, helyesen felépített DNS-t kapcsoljuk ehhez az SV40 DNS-hez az EcoRI kapcsolási helyen keresztül (lásd a 3B. ábrát). A Zfo/nlll enzimmel hasított lineáris, teljes hoszszúságú SV40 vírus —DNS (amely a vad-típusú SV40 vírus—DNS vagy a PBR322 BamUl helyén klónozott SV-IO LNS BamHl enzimmel történő hasítása útján nyerhető) 8 pg mennyiségét 2 egység HindlU (BRL) enzimmel kezeltük egy 50 pl térfogatú, 20 mmol/1 trisz-kloridot (pH=7,5), 60 mmol/l nálrium-kloridot és 7 mmol/1 magnézium-kloridot tartalmazó elegy ben. 30 percig inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten, majd feleslegben levő etiléndiamin-tetraccetsav (EDTA) hozzáadása útján megállítottuk a reakciót és a reakcióelegyet fenollal való extrahálás, majd etanoilal való lecsapás útján mentesítettük a fehérjéktől. Az enzimmel részlegesen hasított DNS-t azután 10 pl TE- pufferoldatban (10 mmol/1 trisz-klorid, pH=7,5 és 1 mmol/1 EDTA) újra szuszpendáltuk. A HindlU helyen levő kohezív végnek EcoRI helyen levő kohezív véggé történő átalakítása céljából 0,1 mmol szintetikus dAGCTGAATTC dekanukieotidot először adenozintrifoszfáttal (ATP) foszforileztünk T4 polinukleotid-kináz segítségével, 10 pl térfogatú, 50 mmol/1 glicin-puffert (pH=9,l), 10 mmol/1 magnézium-kloridot, 5 mmol/1 DTT-t, 0,5 mmol/1 ATP-t és 10 egység kinázt tartalmazó reakcióelegyben. 37°C hőmérsékleten inkubáltuk 1 óra hosszat. A kinázos reakcióclegy 3 pl ahkvot-részét azután hozzáadtuk egy 20 pl térfogatú, 66 mmol/1 trisz-kloridot (pH=7,5), 6,6 mmol/1 magnézium-kloridot, 10 minői DTT-t, 0,05 mg/ml BSA-t, 0,5 mmol/1 ATP-t, 4 pg Hindin enzimmel részlegesen hasított SV40 DNS-t (lásd fentebb) és 10cgységT4DNS-ligázt tartalmazó kapcsolási reakcióelegyhez. A kapcsolási reakciót 20 °C hőmérsékleten körülbelül 16 óra hosszat inkubáltuk. A fenti módon kapcsolt DNS-t azután EcoRI resztrikciós cndonukleázzal kezeltük, hogy EcoRI kohezív véget hozzunk létre a hozzákapcsolt kapcsoló-tagon, majd a terméket fenollal mentesítettük a fehérjéktől, etanoilal lecsaptuk és egy 15 pl térfogatú, fenti összetételű kapcsolási reakcióclegyben kapcsoltuk a pBR322 BamUl — EcoRI fragmentjéhez (0,5 pg); az így kapott terméket azután E. coli 294 tanszformálására használtuk fel. Az így kapott transzformánsokból elkülönített plazmidokat azután szűrővizsgálatnak vetettük alá, hogy megfelelő SV40 DNS-fragmenteket iktathassunk be különböző resztrikciós enzimekkel történő kezelés útján. 5 '0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
