196238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás érett HBsAg felületi antigén és hepatitis B vírus elleni vakcina előállítására
1 196238 2- A találmány a rekombináns dezoxiribonukleinsav-tcclmológiának gerinccsállat-sejtkultúrában történő polipcptid-termelésrc való alkalmazására vonatkozik. így a találmány tárgya elsősorban olyan expresszió-hordozók felépítése, amelyek polipeptideket kódoló dezoxiribonukleinsav (a továbbiakban: DNS) szekvenciákat tartalmaznak, amelyek operábilisan kapcsolódnak az expressziót végző promotor-rendszerekhez és az így felépített expresszió-hordozókhoz. Az ilyen expresszió-hordozók képesek replikációra és a kódolt polipeptid DNS-szekvcncia expressziójára, mind mikrobiális rendszerekben, mind pedig — érdekes módon — különböző gerincesállat-sejttenyészet rendszerekben is. Kiterjed továbbá a találmány az ilyen expresszió-hordozókkal transzformált és így a fent említett DNS-szckvenciák expressziójában irányított emlősállat-scjtkultúrákra is. A találmány olyan különleges expresszió-vektorok előállítására vonatkozik, amelyek DNS-szckvcnciákat használnak fel replikációra, fenotípusos szelekcióra és a hepatitisz—B felületi antigén (HBsAg) génhez és expresszió-promotorjához való kapcsolásra; ezek a szekvenciák természetesek az alkalmazott gerincesállat-sejtrendszer számára és nem károsítják azt. A HBsAg antigén kiválasztódik a kultúra-közegbe körülbelül 22 nm méretű részecskék alakjában és a hepatitisz—B vírus (HB V) antigénes determinánsát vagy determinánsait tartalmazza. Az így termelt hepatitisz—B felületi antigén alkalmas a hepatitisz—B vírus elleni vakcinák előállítására; a jelen találmány kiterjed az ilyen sejtkuitúra-expresszió végtermékeként keletkező HBsAg-nek a HBV vírus ellen hatásos készítményekké, például vakcinákká való átalakítására alkalmas módszerekre, is. A találmány technikai háttere A) Rekombináns DNS-technoiógia bevezetésével a hasznos polipeptide^ rendkívüli sokaságának mikrobiális termelése vái lehetségessé. A gerincesek szervezetében fontos szerepet játszó peptidek egész sorát, mint az emberi növekedési hormont, az emberi proinzulint, az alfa—1 dczacetil-timozint, humán és hibrid leukocíta interferonokat, humán fibroblaszt interferont és számos más terméket sikerült már különféle mikroorganizmusok segítségével előállítani. Ez a technológiai módszer a hasznos polipeptidek igen sokféle különböző fajtájának mikrobiológiai termelését tette lehetővé; így lehetővé vált számos különféle gyógyászatilag is alkalmazható hormon, enzim, antitest és vakcina mikrobiológiailag irányított gyártása is. A rekombináns DNS-technoiógia egyik alapvető eleme a plazmid, a kettősszálú DNS extrakromoszomáüs hurka, amely gyakran sejtenként többszörös kópiában található a baktériumokban. A plazmid—DNS-ben kódolt információ magában foglalja a plazmidnak a leány-sejtekben való reprodukciójához szükséges információt (tehát egy úgynevezett „replikont”, a replikáció forrását), továbbá rendszerint egy vagy több fenotípus-szelekciós jellemzőt, mint az antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát is, ami lehetővé teszi a gazdasejt számbajövő plazmidokat tartalmazó kiónjainak felismerését és szelektív közegekben való prefercnciális tenyésztését. A bakteriális plazinidc^k hasznossága abból a tényből ered, hogy ezeket specifikusan lehet hasítani az egyik vagy niásik reszlrikciós endomikleáz vagy „restrikciós enzim" segítségével, minthogy ezek mindegyike egy-egv különböző helyet ismer fel a plazmid — DNS-epl Ezután heterogén gének vagy gén-fragmentek illeszthetők be a plazmidba oly módon, hogy vég- I elyzetben kapcsolják ezeket a hasítási helyhez vagy a hasítási hellyel szomszédos rekonstruált végekhez. így az úgynevezett replikábilis expreszszió-hordozókat alakítják ki. A DNS-rekombinációt a gazda-organizmusop kívül folytatják le és az így kapott „rekombináns" replikábilis expresszió-hordozó vagy plazmid a „transzformáció” néven ismert művelettel vihető be organizmusok sejtjeibe és így a transzformáns tenyésztése útján nagy mennyiségű rekombináns hordozót lehet kapni. Emellett, ha a gén a bekódolt DNS-iizenct transzkripcióját és transzlációját irányító plazmid-részekhez viszonyítva helyesen van beiktatva , akkor az így kapott hordozó felhasználható a beiktatott gén által kódolt polipeptid közvetlen termelésére; ezt az eljárást nevezik expressziónak. Az expresszió a „promotor” néven ismert DNS- tartományban kezdődik. Az expresszió transzkripciós fázisában a DNS kitekeredik és ezáltal templátja hozzáférhetővé válik a DNS-szekvenciáhól származó „messenger—RNS” iniciált szintézise számára. A messenger—RNS viszont riboszómák ált ti van megkötve ott, ahol megtörténik a messenger—RNS transzlációja az mRNS által bekódolt aminosav-szekvenciájú polipeptid-lánccá. Minden egyes aminosavat egy-egy nukleotid-triplett vagy „kodon” kódol be; ezek együtt képezik a „szerkezet gént”, vagyis a DNS-szekvenciának azt a részét, amely az exprimált polipeptid-termék aminosav-szekvenciáját bekódolja. A transzlációt egy „start’’-szignál iniciálja (ez rendszerint ATG, amelyből a keletkező messenger—RNS-ben AUG lesz). Az úgynevezett stop-kodonok a transzláció végét és így további amin'osav-egységek termelését határozzák meg. A kapott termék — amennyiben ez szükséges — bakteriális rendszerekben lízisnek vethető alá; a termék a jelenlevő egyéb fehérjéktől alkalmas módon történő megtisztítás útján mentesíthető. A gyakorlatban a rekombináns DNS-technológia alkalmazásával teljesen heterológ polipeptidek expiimálhatók — ez az úgynevezett közvetlen (direkt) expresszió — de alternative exprimálható olyan heterológ polipeptid is, amely egy homológ polipeptid aminosav-szekvenciájának egy részéhez van kapcsolva. Az utóbbi esetben előfordulhat, bog)' az előállítani kívánt bioaktív termék a kapott összekapcsolt homológ/heterológ polipeptidben bioinaktívvá válik, mindaddig, míg le nem hasítják valamely sejten kívüli közegben; vö.: 2007676 A sz. brit szabadalmi közzétételi irat és Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980). Ha azt akarjuk, hogy a rekombináns DNS-tecbnológia teljes mértékben nyújtsa azt, ami tőle várható, akkor oly rendszereket kell megtervezni, amelyek optimalizálják a gén-betétek expreszió 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 i
