196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 a reverz transzkriptáz reakció során nem reagált prekurzorok eltávolításakor igen előnyös a reakcilóterméket nem befolyásoló izotóppal jelzett termék mérése. A jelen leírás szerinti módszer értelmében a frakciókat kisméretű műanyag csövekbe gyűjtjük (lásd alább), amelyeket szorosan zárunk. A csöveket közvetlenül a szcintillációs edényekbe helyezzük szcioíillációs folyadék nélkül. A Cerenkov-sugárzást megfelelő műszerrel elfogadható hatékonysággal mérhetjük. Kismennyiségű dezoxiribonukleinsavakkal végzett eljárásokat általában oly módon végzünk, hogy az elegyhez hordozó dezoxiribonukleinsavat adunk. Ennek értelme az előállítani kívánt tlezoxiribonukleinsav kinyerési hatékonyságának növelése, amely egyébkéftt az edény falához való nem specifikus kötődés miatt alacsony lehet, de csökkentheti a kitermelést többek között dezoxiribonukleinsav kicsapás esetén a kooperatív hatás hiánya is. A jelen leírás szerint eljárva adagolt hordozó dezoxiribonukleinsav nélkül is megfelelő dezoxiribonukleinsav kitermelést érünk cl, még ng mennyiségű dezoxiribonukleinsav eseten is. A hordozó rezoxirihonukleinsav nélküli eljárás két egyértelmű előnnyel rendelkezik: először, az enzimek által katalizált reakciók során nem specifikus dezoxirihonukleinsav jelenlétének hiányában nem keletkeznek nem specifikus reakciótermékek; másodszor nem specifikus nem rekombináns transzfer vektorok nem keletkezhetnek a szennyező dezoxiribonukleinsav hiányában. A fentiekben megadott módszerek kombinációjával lehetségessé válik a humán növekedési előhormont meghatározó dezoxi-nukleotid-szekvencia klónozása egyetlen beteg agyalapi mirigyéből kiindulva. Az alábbi példákban részletesen ismertetjük az izolálási és tisztítási lépéseket és nukleotid-sorrend analízissel bizonyítjuk a klónozott gén azonosságát. A találmány szerinti eljárás során a különböző alkalmazható DNS szekvencia variánsok a következőképpen jellemezhetők: 5'-GG ATCCTGTGG ACAGCTCACCTAGCTGCA ATG.^G C ACL.,r G G L_23 - Q R_22 - S_22 W_2I GZ_21 - A C L - Q R_i9 "S_w X_m T \ _ix X_17 T Y_,7 - X_tft - T Y_16 - G C L_„ - T T K_l4 - G C L_n C_P X_„ - T Y_u - T G K_,„ X.,-CCL_„-TG G_7 X_(, - CAJ.,-GAJ.rGCL.jGTL_,-CC L_, -ttk,ccl2acl,atm4ccl5x;ty6qr7-S7 G Z8 X9T Yy TT K|„ G A K„ A A K,, G C L„ - A T G„ X,5 Wl6 GZ16GC L17 C A Kw W„ G Z„ - X» T Y» C A K,,CA Jr X23 TY^ GCL,4TTK,5- G‘A K,'6 ACL„TA K,8 CAJ,VG A JWTT K„ - G A J32 G A J3; A C L„ T A K35 A T M36 C C L37 - A A J38 G A J39 C A Jyn A A J4) T A K4-> 0 R43 S43 - T T K44 X4, C Ä J46 A A K47 C C Ljg C A J3y A C L5u - Q RSI S5i X5, T Y„ T G K53 T T K,4 QR5, S,5 G A JVl - Q R57 S5s A t M« C C L3y A C L*, C C LM Q Rh2 S62 - A A K63 Ww GZ« G A J65 G A J«, A C L67 C A JM - C A Jft9 A A J7o Q R7| S7| Ä A K72 X73 T Y73 G A J74 - x75ty75 x76 t y% w77 g z77 a TM78 q r79 S79 X«, - T YÄ T Y„ XR2 T Yg2 A T M83 C A J84 Q Rh5 S85- T G G Xsy T Y87 G A C C Lw G T U C A J9I - T T K91 Xy3 T Y93 W94 G Zy4 Q R9< S9, G T L*. - TTK97GCL«, A A Kyy A A Ki00TY101 GTLI(I2- T A K1()1 G G T|W G C L|d3 Q R|(x> Sím G A K|H7 -O RiatSui* A A K)tt| G f LlinT A Km G A Kll2Xn3- T Yll3 X1H TV,,, A A J11S G A Kll6 X117 T Yll7 - G A J||8G A J|t9 G G Lp„ A TMr, G A Jl22 A CLt23- X,24T Yl24 ATG G G L126W127X|28TY128G AJ129- G Ä Ki3oG G Lp, Q R,32S,32CCL133 W134 ACL13s- G G L| V| C A J|37 A TM|38TTK|39 A A J14ft C A J)4I - A C L|42 T A Kl43 O I*,* S,44 Á A Jl45 T T K146 - G A K147 A C L148 A A K|49 Q Rl5n S15fl C A K15l - A A IC,« C A K)53 G A Kl54 G C L155 X156 X157 - A A d15« A A K159T A kih(l G C L]61 X162TY162 XlMTYlffl TAK.JG K,65 T T K)66 W167 G Z167 - A A J1WG AKlfisATG G A Kl7( A A J172GTL]73- G A J174 A C L175 TTK176 X177 T Y177 W178 G Z178 - A T M|79 G T L181, C A J|81 T G K182 W183 G Z183 - Q R1X4 Sdu G T Lt85 G A J18fl G G L187 Q Rlgg - TG K18,,CG LiynTTKI91T AGGTCCCCGGGTCCCATCCCTCTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAA G TTG C C ACT CCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAATTAAGTT G C A T C poli-3', ahol A=dezoxi-adenil-csoport, G=dczoxi-güanil-csoport, C-dezoxi-citozil-csoport, T-timidilcsoport, J=A vagy G, K=T vagy C, L=A, TCvagy G, M=A, C vagy T, XU=T vagy C, ha Y„=A vagy G, és C, ha Yn=C vagy T, Y„=A, G, C vagy T, ha X„=C, és A vagy G, ha X =T W„=C vagy A, ha Z„=G vagy A, és C, ha Zn=C vagyT, Z„=A, G, C vagy T, ha Wn=C, és A vagy G, ha W = A QR„=fc, ha S, = A, G, C vagyT, és AG, haS„=T vagy C, S„=A, G, C vagy T, ha QRn=TC, ésT vagyC, ha QR„=AG, továbbá, ahol az n szám jelzi a humán növekedési hormon aminosav-szckvcnciájában a helyzetet, amelynek a genetikai kód értelmében a nukleoiid-szckvenciában a triplet megfelel, cs ahol az aminosav helyét a fehérje amino-terminális végétől számozva számozzuk. /. példa , Egyetlen személytől vett szövetből származó humán növekedési előhormon génjének klónozása. Transzfenoidális agyalapi mirigy műtéttel hat, agyalapi mirigy tumorban szenvedő beteg agyalapi mirigyét eltávolítjuk, gyorsan lefagyasztjuk és folyékony nitrogénben tároljuk. A következőkben megadott eljárás során mindegyik agyalapi mirigyet külön-külön kezeljük, bár mind a hatot azonos időben dolgozzuk fel. Felvágjuk a mirigyeket és négy mólos, 1 mól merkapto-metanolt tartalmazó, 5,0 pH-ra pufferezett guanidium-tio-cianátban homogenizáljuk 4 °C hőmérsékleten. A homogenizátumokat 1,2 ml 5,7 mólos, 10 mM EDTA-t tar5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 oO 55 9
