196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 ból álló fehérje-szintézis képességét. A fehérjét gélelektroforézissel mutatjuk ki. 1 Az izolált hírvivő ribonukleinsavval komplementer dezoxiribonukleinsavat (cDNS) reverz transzkriptáz enzimmel szintetizáljuk két reakcióciklusban, kétszálú cDNS molekula előállítására. A módszer részleteit az alábbiakban adjuk meg. A heterogén, reverz transzkriptázzal előállított kétszálú dezoxiribonukleinsavat a molekulák hosszúsága szerint gélelektroforézissel frakciónáljuk. A körülbelül 800 bázispárnyi hosszúságú ponthoz vándorló dezoxiribonukleinsavat tovább vizsgáljuk. A 800 bázispárból álló cDNS termék nagy része a növekedési hormont kódolja, ezt elkülönítjük és PvuII és BglII restrikciós endonukleázokkal kezeljük. 'A Pvuíl enzim a cDNS növekedési hormont meghatározó molekulákat oly módon hasítja, hogy 495 bázispárból álló fragmenset kapunk. A BblII enzim az első fragmensen belül egy helyen hasít. A hasítás és a frakcionálás után megkapjuk a humán növekedési hormont meghatározó cDNS-t tartalmazó csíkot. A nem hasított, heterogén, körülbelül 800 bázispárnyi hosszúságú kétszálú cDNS-t mindkét végén specifikus kötő oligonukleotid szekvenciák előállí! tására kezeljük, amiután lehetségessé válik hasonló restrikciós specificitási transzfer vektorba való beépítése. I Klónozásra kiválasztunk egy jó szelekciós lehetőséget biztosító és stabil repükációs tulajdonságú transzfer vektrot. A kezelt, 800 bázispárból áló cDNS-t rekombináns transzfer vektor előállítására, rendelkezésünkre álló módszerekkel, előre meghatározott helyen beépítjük a transzfer vektor dezoxiribonukléinsavba, amikor rekombináns transzfer vektort kapunk. Mikroorganizmus sejteket transzformálunk a rekombináns vektorral. A transzformásokat az előre meghatározott helybe :való beépítés szerint adott kritériumok szerint szelektáljuk. Izolált telepeket, mindegyik egyetlen transzformált mikroorganizmus sejtből származókat, kiemelünk és a rekombináns transzfer vektor dezoxiribonukleinsav kiónok replikációjái a különálló tenyészetekben növesztjük. Ezután izoláljuk a transzfer vektor dezoxiribonukelinsavat és gélelekíroforézissel vizsgáljuk a transzfer vektor nagy ságát esetleges hibák kiküszöbölésére, például deléció kimutatására. Rekombináns transzfer vektor dezoxiribonukleinsavat tartalmazó telepeket, amelyeket megfelelő nagyságú molekulát tartalmaznak, kiválasztjuk és transzfer vektor dezoxiribonukleinsav izolálására nagyobb mennyiségben tenyésztjük. A dezoxiribonukleinsavat restrikciós enzim-analízisnek vetjük alá. A transzfer vektorba beépített dezoxiribonukleinsavat minden egyes klón esetén azonosítjuk, oly módon, hogy a beépítés helyén restrikciós enzimekkel hasítunk, enzimként PvuII és BglII enzimeket használunk, amelyek jellemző nagyságú fragmenseket hasítanak ki, így a növekedési hormon cDNS framgensét. Az összes igényeknek eleget tevő kiónt kiválasztjuk és vizsgáljuk a kiónozott növekedési előhormon génjének nukleotid-sorrendjét és felhasználjuk a terméket megfelelő kifejeződő plazmidba való beépítésre. Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti eljárást. A növekedési hormont az agyalapi mirigy lebenye termeli. Alapjában véve a növekedési hormon génjét bármely szövetből izolálhatjuk. Ugyanakkor a humán növekedési hormon génjében köztes szekvenciák vannak, amelyek a normális eukarióta környezeti viszonyok között átíródnak és ezután köztes szekvenciák nélküli úgynevezett „érett” hírvivő-riponukleinsav jön létre. Prokarióta sejtbe, például baktériumba transzferált dezoxiribonukleinsav szekvenciák ilyen köztes szekvenciákat nem tartalmazhatnak, mivel a prokarióta sejt képes lehet átfordítani ezeket és ily módon nem a kívánt protein termék keletkezik. Az adott dezoxinukleotid-szekvenciát ezért, gyakorlati okoból, a növekedési hormont aktívan szintetizáló sejtekből izolált hírvivő ribonukleinsavról kell lemásolni. Egy adott protein genetikai információját hordozó cDNS eukarióta hírvivő ribonukleinsavból kiinduló klónozását általánosságban Ullrich, továbbá Seeburg és munkatársai közük (lásd előbb!). Röviden összefoglalva az eljárás az alábbi lépésekből áll: 1) Izoláljuk a gyakorlatilag teljes poliadenilezett ribonukleinsavat a differenciált sejtekből vagy abból a szövetből, amely az adott proteint kiválasztja. 2) Az izolált ribonukleinsavval a bázis-sorrend szempontjából komplementer dezoxiribonukleinsav szálat szintetizáljuk, a szintéziskor reverz iranszkiptáz enzimet használunk és ribonukleinsav-dezoxi-ribonukleinsav hibridet kapunk. 3 A hibrid ribonukleinsav részét szelektíve hasítjuk, ezután egyszálú CDNS molekulát kapunk. 4) Az egyszálú cDNS molekulával komplementer dezoxiribonukleinsavat szintetizálunk, ily módon kétszálú cDNS molekulát kapunk. 5) A megfelelő nagyságú molekulákban gazdag készítmény előállítására frakcionáljuk a kétszálú cDNS készítményt. 6) A cDNS beépítésére kiválasztjuk és előállítjuk a megfelelő transzfer vektort. 7) A cDNS muiekuiát és a transzfer vektort dezoxivibonukleinsav-ligáz segítségével kovalensen kapcsoljuk, amiután rekombináns transzfer vektrot kapunk. 8) Transzformálást követően replikájuk az adott rekombináns transzfer vektort, szelektáljuk és megfelelő mikroorganizmus törzsön növesztjük. Az agyalapi mirigy anterioláris sejtjeit vagy rranszfenohidális hipofízis műtétet követően ember agyalapi mirigyből vagy bizonyos emberi agyalapi mirigy tumorsejtekből nyerjük növesztést követően. Vagy az egyik, vagy a másik forrásból származó ribonukleinsavat a hozam növelésére részlegesen tisztítjuk és íemplátként használjuk a cDNS molekula leírására. A részleges tisztítás történhet szedimentációval, szacharóz grádiensen, amikor eltávolítjuk a túl kicsi vagy túl nagy ribouikleinsav molekulákat. A poliadenilezett ribonukleinsav izolálására o!igo-dT-cellulózon kromavografálva tovább tisztítjuk a terméket, a poliade•rilezett ribonukleinsav ugyanis az eukarióta sejtekben a hírvivő ribonukleinsav alapformája. A részlegesen tisztított hírvivő, ribonukleinsav templátként használhatjuk fel az enzimes, nevezetesen reverz transzkriptázzal kivitelezett cDNS előállításához. A kétszálú cDNS molekula előállí-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
