196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 cHGHSOO kiónozott humán növekedési előhormon dezoxiribonukleinsavat beépítjük DNS Iigázzal a ptrpEDSO HindlII helyére. A rekombináns transzfer vektort felhasználjuk az E. coli XI776 törzs transzformálásra. A transzformánsokat ampicillint tartalmazó lemezeken szelektáljuk. Több klónbói izolált plazmid dezoxiribonukleinsavat a beépülés orientációjának vizsgálatára BamHI és PstI enzimekkel hasítunk. Az orientáció helyes olyan esetben, ha a növekedési előhormon kodonjai a triptofán opcronnal atomos fázisban kerülnek leolvasásra; ez együtt jár a PstI hely aszimmetrikus elhelyezkedésével, amikor 700 bázispárból álló fragmens keletkezik. A nem helyes orientáció esetén 290 bázispárból álió fragmens jön létre. A korrekt orientációjú plazmidokat ptrpED50—HGH jellel jelöljük és E. coli trpOE— 1 sejtekbe transzformáljuk. 4. példa A humán előnövekedési hormon kifejezése. A ptrpED—50—HGH plazmidban a trpE és a trpD gének kifejeződése a triptofán szabályozása alatt áll, ily módon a fehérje termék mennyisége növekszik egy indukálószer jelenlétekor, például p-indolil-akrilsav adagolásakor. Az E. coli trpOE— ) ptrpED50—HGH indukciójakor várhatóan növekszik a trpE gén termékének és a trpD- növekedési előhormon fúziós fehérjéjének mennyisége. Az utóbbi az amino-terminális részt tartalmazza és a trpD gén terméke kapcsolódik a humán növekedési előhormonhoz. E coli trpOE— l/ptrpED50—HGH tenyészete ß-indolil-akrilsavval indukálunk és a 3 ml-es mintákat 2 pCi Cl4-jelzett aminosavakkal jelölünk állandó időpontokban az indukciót követően. A 0 és 4 órás indukált tenyészet mintáit formaldehiddel kezelt Staphylococcus aureus sejtekkel immunokicsapjuk az antigén-antitest komplex összegyűjtésére, ahogy azt Martial és munkatárai leírják (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 74, 1816, 1977). A proteint oldjuk és nálrium-dodecil-szulfát-poliakril-amid gélen elektroforézisnek vetjük alá, így frakcionáljuk. Az eredményeket a 4. ábrán adjuk meg. Az a csík jelzi a T4-bakteriofággal fetőzött E. coli sejtekből származó C,4-jelzett fehérjét, amit a nagyság jelzésére használunk. A b-g jelek az indukciót követő 1, 0, 5, 1, 2, 3 és 4. órában vett jelzett minták proteinjeit mutatják. A h csík az indukált tenyészet 4. órájának immunreakcióval kicsapott fehérjét jelzi, a kicsapást a humán növekedési hormon antiszérumával végeztük. Az i jel az indukált tenyészet 4. órájában nem immunszérummal kicsapott jelzett proteinek helyzetét mutatja. A j csík a nem indukált jelzett protein immuncsapadékát adja meg. A felső és az alsó nyilak sorrendben a trpE és a várt trpD —HGH fúziós fehérje elhelyezkedését jelzik. A baloldali számok a molekulasúlyt jelzik (xlO \ Az eredmények szerint az indukciót követően megjelenő trpD—HGH fehérje specifikusan kicsapódik a humán növekedési hormon szérumával. Bizonyos mennyiségű immunkicsapható trpE protein is jelen van. Mivel a trpE és trpD fehérjék szokásosan komplexben asszociáltak, valószínűnek tűnik, hogy a fúziós protein trpD részének jelenléte miatt asszociáció következik be a trpE fehérje és a típD —HGH fúziós protein között. Azonban mindenképpen bizonyítékok támasztják alá a klónozott humán előnövekedési hormon génjének kifejeződését E. coliban. Bár a találmány szerinti eljárás specifikus megvalósítások alapján íródott, az eljárás alkalmas módosításokra, variációkra, más felhasználásokra vagy adaptációkra, általában és a találmány alapgondolataiban és ismert vagy szokásos gyakorlattá váló eljárások megszületése esetén mindez a következő igénypontok által meghatározott oltalmi körbe tartozik. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás humán növekedési előhormont kódoló gént tartalmazó transzfer vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi DNS-szekvenciát: 5'-GG ATCCTGTGG ACAGCTCACCTAGCTGCAAT G_,6 G C L_,5 A C L_,4 - G G L_,3 Q R_„ - S_„ W_7, GZ_n - A C L - O R_w s;y X_,sT Y_iKX_,7T Y_!7 - X_w - T Y_16- GCL_I,-TTK_ll-GCL_nC_l,X_„-TY_11- T G K in X_, - C C L_.s -TGG., X_h CAJ_SG A J_4 - G CL_3GTL_,-CCL_,TTK,CCCL-A C L, ATM4CCL, XJY„ Q R7 S7 W8 G Z8 Xy - TYJTKWG AK„ A A KPG CL„ ATG14X„Wlh GZI6GC L17 C A Kw W19 G Z19 X20 T Y,0 - CAK,,CAJ„ X,3 TY,,GC L,4 TTK„GA K* - ACL,TA K,„ C AJ^GAJjjTT K„ G A J32 - G A J* ACL,4TAK3,AT M36 C C L37 A A J38 - G A J39 C A J4Ü A A J41T A K47 Q R43 S43 f T K44X4S - C A J4(, A A K41CCL,sCAJ„ACL,0QR5lSslx3,t y„ t g k„ t t km qr„ s„ g a j56 q r57 s58 -A T M,,s C C Lw A C Lw C C L61 Q R„, S,2 - A A K„i WM G ZM G A J(,5 G A J66 A C Lfi7 C A J« - C A JM A A J7I, Q R71 S7, A A K72 X73 T Y„ G A J74 - X7S r Y7S X7(i 1 Y76 W77 G 2^77 A I M7S Q R79 S79 Xs0 - T Ys„ XM T Ym X,, T Yra A T M83 C A J„ Q Rö SK5 - T G G X„ T Y„ T Ys7 G A Jss C C Lm GTL,,C A J„ t T K,p X„, T Y93 G Q R9, - S9, G T U TTK„G C L* A A Kw A A Km Xm - T Y1(li G T Lm T A Km G G T1W G C L,!)S Q Rm - Skk, G A Ku)7 Q R1(IS Slu8AAKliBGTL110TAKin- G A K,„ X113 T Y||3 Xll4 T Y!14 A A Jn5 G A KU6- x,P t y117 G A J,,.. G A Jll9 G G Lpo A T M,„ - G' A .1,A C Lp, XP4 T Yp4 A T G G G Ll26 W137 - GZp7XPNTYnKGÄJpi)GAK130GGLl31QR132- Sp,, C C Lm W134 G Zl34 A C Ll35 G G L136C A J137 - A T M13kT T K,,, A A J14(l C A Jl4, A C L14,TA K143 - Q Rpj S144 A Á J443 T T KI46 G A K147 A C L148 - A A Kp,, O R[5o Sis,, C A K,51 A A K152 C A K;53 - G A K|54 G C Lj55 X|5„T Yi56 X4j7 A A J|58 A A K)59 - T A Klht, G C Lp.i X1(,; T Yl(l2 X4fi3 T Y163 T A K464 - T G K1M T T W167 G Z167 AAJ]68GAK168- A T G G A K17i A AJ |72 G T Ll73 G A J174 A C Ll75 - 1 T Kp„ Xl77 T Y|77 W|78 G Z178 A T Mm G f L18() - C A J|X1 T G K1S2 W|S3 Ci Z)83 Q Ris-i S184 G T L185 - G A G G L|X7 Q R48,s S|Sft T G K lti9 C G L19(l - TTKmTAGGTCCCCGGGTCCCATCCCTCTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTC-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 13
