196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
196236 2 re* helyezzük és éjszakára 37°C-on inkubáljuk. Mivel a pBR322 plazmid magában foglalja a tetraciklin rezisztencia génjét is, a plazmiddal transzformált E. coli telepek az antibiotikumot tartalmazó kultúrákban növekedni fognak, a nem transzformáit E. coli telepektől eltérően. Ezért a tetraciklint tartalmazó kultúrában történő tenyésztés lehetővé teszi a megfelelően transzformált gazdák szelekcióját. 5. E. coli telepek szűrővizsgálata hihridizálással Tetraciklint tartalmazó inkubált L-agar-lemezeken tenyésztett baktérium telepeket megvizsgáltuk az ampicillin iránt mutatott érzékenység szempontjából. A pBR322 plazmid magában foglalja az ampicillin rezisztencia gént. Ez a gén a javasolt hely a hibrid gén beépítésére. Ezért a választott felismerő helyen beépített DNS-t tartalmazó plazmiddal transzformált telepek érzékenyek az ampicillinre, de rezisztensek maradnak a tetraciklinnel szemben. Az ampicillinre érzékeny, de a tetraciklinre rezisztens E. coli telepeket tetraciklint tartalmazó L-agar lemezeken tartott Millipore cellulóznitrát szűrőre vittük át. A telepeket éjjel 37°C-on tenyésztettük, és a Millipore szűrőt tetraciklint és 150 pg/ml klóramfenikolt tartalmazó friss L-agar lemezre helyeztük át és további több óráig inkubáltuk 37°C-on, hogy növeljük a sejteken belül a másolatok számát. (2. ábra) A Millipore szűrőket ezután telep hibridizálásra használjuk: M. Grun- stein és D. S. Hogness, „Colony Hybridization: A Method For The Isolation Of Cloned DNAs That Contain A Specific Gene”, Proc. Natl. Acad. Set. USA, 72, 3961-3965 o. [1975]. “P-ve! jelzett HBV-DNS-el, melyet előzőleg mintaként állítottunk elő. A szűrők radioautográfiája szerint az autentikus HBV-DNS-sel komplementer DNS szekvenciákat tartalmazó telepek vannak jelen. HBV antigenicitású polipepíideket szintetizáló telepek kimutatása A tetraciklinre rezisztens és az ampicillinre érzékeny és autentikus HBV DNS-sel hibridizált telepeket vizsgáltuk meg abból a szempontból, hogy legalább egy, HBV antigén képességet vagy HBV antigén fajlagosságot mutató polipeptidet termelnek-e. A telepeket ismét a tetraciklint tartalmazó L,-agaron lévő Millipore szűrőkre vittük át és 37°C-on egy éjjelen át inkubáltuk. Egy második L-agar lemezt befedtünk E. coli C600-tenyészettel (0,1 m! 2 ml lágy ugarban), melyet egy X vir. bakteriofág virulens törzsével megfertőztünk (a fertőzés sokszorozódási indexe kb. 1) és szintén inkubáltuk 37°C-on, egész éjjel, mely idő alatt a baktérium felület egybefolyóan lizálódik (azaz a (X virfág) lényegében valamennyi gazda sejt falat felrepesztette.) A találmány szerint transzformált sejteket tartalmazó Millipore szűrőket felemeltük * (P. C. Wensink és tsai: „A System For Mapping DNA Sequmences In The Chromosomes Of Drosophila Melanogaster”, Ceu, 3, 315—250 (J974)). á lemezekről és a telepekkel lefelé tartva érintkezésbe hoztuk a X virfággal lizált E. coli C600 L-agar lemez felületével. Ezt a kontaktust kb. 10 percig tartottuk fenn, hogy a Millipore szűrőn lévő sejtek 5 megfertőződhessenek a X virfággal. A Millipore szűrőt ezután friss L-agar lemezre helyeztük és további 5 óráig inkubáltuk. A rugalmas polivinillemezeket* eközben HGV antitestekkel vontuk be. |S. Broome és W. Gilbert, Immunological 10 Screening Method To Detect Specific Translation Products”, Proc. Natl. Acad, Sei., USA, 75, 2746—2749 (1978)]. A Millipore szűrőn lévő lizált transzformált baktérium telepeket a bevont polivinil lemezekkel érintkezésbe hoztuk és úgy hagytuk 0°C-on 3 óráig. Ez az érintkezésből azt eredményezi, hogy a sejtekből lizált, Millipore szűrőn lévő HBV antigének kötődnek a lemezen lévő HBV antitestekkel. A bevont lemezeket leválasztottuk a Millioorc szűrőről, majd mostuk és 125 I- 20 ve! jelzett HBV antitesttel inkubáltuk. Az inkubáció eredményeképpen a lemez azon helyein tapasztalható radioaktív jelzettség, ahol a Millipore szűrőről származó HBV antigének előzőleg a lemez HBV antitestjeivel kapcsolódtak össze. Mosás és 25 radioautográfta után (Broome és Gilbert... lásd fent), a HBV antigén fajlagosságot mutató polipeptídeket termelő telepeket a radiautográf alapján lokalizáltuk. 30 Rekombináns DNS molekulákból előállított polipeptidek és gének alkalmazása HBV antitestek kimutatására emberben 35 A HBV antigén képességű polipeptideket, és az ezeket kódoló Struktur géneket és fragmentjeit felhasználhatjuk az emberben található HBV antitestek kimutatására és az ezzel a vírussal fertőzött emberek és vérmintáik felismerésére. 4 0 így pl. a találmány szerinti rekombináns DNS molekulákkal transzformált gazdasejtek által termelt HBcAg-t felhasználhatjuk a napjainkban használatos hepatitisz B vírus kimutatását szolgáló immunológiai tesztben, azaz radioimmunotesztben vagy ELISA-ban (enzimmel kapcsolatos immunoszorbens vizsgálat). A radioimmuno vizsgálat egyik fajtájánál laboratóriumi állatban kiváltott anti-belső antigén antitestet szilárd fázishoz pl. a kémcső belső falához kötjük. A kémcsőbe ezután ' 50 HBcAg-t adunk, amely az antitesthez kötődik. Az antigén-antitest komplexszel bevont kémcsőbe adagoljuk a páciens szérum mintáját radioaktív izotóppal, pl. radioaktív jóddal jelzett ismert mennyiségű HBV anti-belső antitesttel együtt. 55 A paciens szérumában bármilyen HBV antitest versenyez a jelzett antitesttel az antigén-antitest komplexen lévő szabad kötőhelyekért. A szérumot hagyjuk kölcsönhatásba lépni, a folyadék feleslegét eltávolítjuk, a kémcsőt mossuk és a 60 radioaktivitás mennyiségét mérjük. Az alacsony radioaktív szám azt a pozitív eredményt mutatja, hogy a páciens széruma HBV antitestet tartalmaz. 65 * („Immunological Screening Method To Detect Specific Translation Products”, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 75. o., 2746-49 (1979)) 7
