196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására

1

196236

2

kokat (125 cm2) oltunk be 5.x H)3 sejttel mintegy 24 órával a DNS-nek ezekhez a sejtekhez való hozzáadása előtt. A sejtekhez való hozzáadáshoz előkészítjük a DNS-t a fentebb leírt két plazmid hasításával megfelelő restrikciós endonukleázokkal, a hasított DNS megfelelő mennyiségeit (általánban kb. 10 gg összesen) kombinálva különböző relatív arányokban, a DNS-t etanolla! kicsapva, újra szuszpendálva 200 pl oldatban, amely 1 mmól/1 trisz HCl-t (pH=7,2); 0,1 mmói/i HEPES-t (pH=7,2) tartalmaz, és az így létrejött oldatot lassan pipettázzuk 250 pl oldatba [2xHBS: 280, mmól/1 NaCi; 3,0 nimói/l Na2HP04; 100 mmól/1 HEPES (pH-7,2)j, miközben folyamatosan leszívjuk a HBS oldatot.

Miután hagytuk képződni a kaleium-íoszfát- DNS csapadékot, hozzáadunk 500 pl szuszpenziót egy egysejt-réteghez (mono-layer), amelyről a növesztő tápközeget eltávolítottuk. Megbillentjük a lombikot, hogy biztosítsuk a teljes mono-layer beborítását. Ez után 5 ml tápközeget adunk hozzá és a lombikot inkubáljuk 4 órán át 37 °C hőmérsékleten.

Ezután a szuszpenziót a sejteket tartalmazó lombikhoz adjuk, tápközeget adunk hozzá, majd tenyésztjük a sejteket. Ezeket a transzformánsokat tripszinezzük egy klónozó hengerben, és áívisszük ezeket kis lombikokba. Végül átvizsgáljuk az ezeknek a transzformánsoknak a monolayer-jeiből származó tenyésztő közegek mintáit, hogy kimutassuk azokat a transzformánsokat, amelyek konstitutiven HBsAg-t választanak ki. A HBsAg-t összegyűjtjük, az extraktumból izolálva ezt szabd-, lyos időközönként. Következésképpen ez a példa demonstrálja a HBV antigenicitását mutató polipeptidek termelését állati setjekben.

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás legalább egy, hepatitisz B vírus (BV) antigén antigenicitást mutató polipeptid előállítására, azzal jellemezve

; hogy

I. a) HBV antigenicitást mutató polipeptidet kódoló DNS szekvenciát, ahol az említett DNS szekvencia

— valamely hepatitisz B vírus felületi antigént vagy antigenicitást mutató fragmenseit kódoló DNS szekvencia, vagy

— valamely hepatitisz B vírus belső antigént vagy antigenicitást mutató fragmenseit kódoló DNS szekvencia, vagy

— a fentebb említett DNS szekvenciákat rész ként magában foglaló valameny DNS szekvencia, amely valamely hepatitisz B vírus antigén antigént citását mutató polipeptidet kódol,

állítsunk elő olyan módon, hogy a hepatitisz B Dane-részeeskét, vagy az adott HBV antigenicitást mutató polipeptidet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó más rekombináns vektort valamely restrikciós enzimmel hasítjuk, az így kialakított termékei megfelelően hasított klőnképző hordozóba ligáljuk, és kívánt esetben az így kialakított rekombináns klőnképző hordozóba operatívan működő, kifejeződést szabályozó szekvenciát iktatunk be, vagy

ATGGACATTGACCCTTATAAAG

AATTTGGAGCTACTGTGGAGTT,

ACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACT

TCTTTCG'TTCCGTaCGAGATCTT

ctagataccgccgcagctctgt

atcgggatgccttagagtctcc

TGagcattgttcacctcaccata

ctgcactcaggcaagcaattct

ttgctggggagacttaatgact

ctagctacctgggtgggtacta

atttagaagatccagcatctag

gcacctagtagtcagttatgtc

aacactaatgtgggcctaaagt

TCAGACAATTATTGTGGTTTCAC

ATTTCTTGÎCTCACTTTTGGAAG

AGAAACGGTTCTAGAGTATTTG

GTGTCTTTTGGAGTGTGG ATTCG

CACTCCTCCAGC TTATAGACCAC

CAAATOCCCCTATCCTATCAAC

G CJT CCGGAGACT ACTGTTGTT A

GACGACGAGGCAGGTCCCCTAG

AAGAAG AACTCCCTCGCCTCGC

AGACGAAGATCTCAATCGCCGC

GTCGCAGAAGATCTCAATCTCG

GGAATCTCAATGT képletű vagy az

CATCACATC A G GATTCCTAGGA

CCCCTGCTÇGTGTTACAGGCGG

GGTTTTTCTTGTTG ACAAGAATC

CTCACAATACCGCAGAGTCTAG

ACTCGTGGTGGACTTCTCTCAAT

TTTCTAGGGGGAACTACCGTGT

gtcttggccaaaattcgcagtc

CCCAATCTCAATCACTCACCAA C CTCCTGTCCTCCAACTTGTCCT CGTTATCGCTGGATGTGTCTGC

ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT CTTGTTGGTTCTTCTGGACTATC AAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCt CTAATTCCAGGATCATCAACCA CCAGCACGGGATCCTGCAGAAC CTGCACGACTCCTGCTCAAGGA ATCTCTATGTATCCCTCCTGTTG CTGTACAAAACCTTCGGATGGA A ACTG CACCTGTATTCCCATCCC A T C A T C C T G G G CTT TC G G A A À A TTCCTATGGGAGTGGGCCTCAG CCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTA CTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTT GGTAGGGCTTTCCCCCATTGTTT GGCTTTCAGTTATATGGATGAT GTGGTATTGGGGGCCAAGTCTG rACAGCATCTTGAGTCCCTTTTT ACCGCTGTTACCAATTTTCTTTT GTCTTTGGGCATACATT képletű DNS-t,

vagy ezek olyan fragmenseit, amelyek HBV antigenicitást mutató polipeptideket kódolnak, vagy mindezek bármilyen, a természetes tïiplet-degeneaciónak megfelelő változatait megfelelően hasított klőnképző hordozóba ligáljuk, és kívánt esetben az így kialakított rekombináns klónképző hordozóba operatívan működő, kifejeződést szabályozó szekvenciát iktatunk be, majd

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

16